Toll樣受體在不同轉(zhuǎn)移能力人乳腺癌細(xì)胞株中的差異表達(dá)及意義研究

趙毅玲 姚麗紅 李彩娟 單叔煤 奚克敏 孫迎燕

[摘要] 目的 探討Toll樣受體在不同轉(zhuǎn)移能力人乳腺癌細(xì)胞株中的差異表達(dá)及意義。 方法 分別選取高轉(zhuǎn)移能力人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB231與低轉(zhuǎn)移能力人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，采用RT-PCR、實時熒光定量PCR及細(xì)胞免疫熒光檢測測定其蛋白水平及TLR1-TLR10mRNA水平，比較兩株細(xì)胞TLRs表達(dá)情況及差異性。 結(jié)果 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7mRNA、MDA-MB-231 mRNA、蛋白水平均存在TLRs廣泛表達(dá);兩種細(xì)胞株TLR4、TLR6、TLR8及TLR9 mRNA水平表達(dá)存在明顯的差異性（P<0.05）;MDA-MB-231的TLR4、TLR6、TLR7及TLR5水平明顯高于MCF-7（P<0.05）。 結(jié)論 TLRs在不同轉(zhuǎn)移能力人乳腺癌細(xì)胞株中表達(dá)廣泛但水平存在差異，其中TLR4受體差異表現(xiàn)最為明顯，考慮TLRs表達(dá)差異與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] Toll樣受體;不同轉(zhuǎn)移能力;人乳腺癌細(xì)胞株

[中圖分類號] R979.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）17-0032-04

[Abstract] Objective To investigate the differential expression and significance of Toll-like receptors in human breast cancer cell lines with different metastatic ability. Methods High-metastatic human breast cancer cell line MDA-MB231 and low metastatic human breast cancer cell line MCF-7 were selected， and their protein levels and TLR1-TLR10 mRNA level were determined by RT-PCR， real-time fluorescent quantitative PCR and cellular immunofluorescence assay.The expression and difference of TLRs in the two cells was compared. Results The expression of TLRs was widely expressed in human breast cancer cell line MCF-7 mRNA and MDA-MB-231 mRNA and protein expressions. There are significant differences in the expression of TLR4， TLR6， TLR8 and TLR9 mRNA levels in the two cell lines（P<0.05）. The levels of TLR4， TLR6， TLR7 and TLR5 in MDA-MB-231 are significantly higher than those in MCF-7 （P<0.05）. Conclusion TLRs are widely expressed in different metastatic human breast cancer cell lines， while the expression levels are different. The difference of TLR4 receptors is the most obvious， considering that the difference of TLRs expression is related to breast cancer cell metastasis ability.

[Key words] Toll-like receptor; Different metastatic ability; Human breast cancer cell line

近年來分子水平的研究為乳腺癌的診治帶來了新的方向和希望，相關(guān)分子標(biāo)志物表達(dá)的檢測有助于了解惡性程度和判斷預(yù)后，繼而通過合理治療以達(dá)到控制腫瘤的目的[1]，進(jìn)而實現(xiàn)對后天免疫系統(tǒng)的調(diào)整。最新研究證實，TLRs在多種腫瘤細(xì)胞中均有廣泛表達(dá)[2]，但目前還鮮有關(guān)于其在乳腺癌中的表達(dá)研究。本研究擬采用超聲彈性成像技術(shù)、免疫組織化學(xué)染色方法、實時定量PCR技術(shù)對乳腺癌患者患病部位進(jìn)行超聲彈性成像評價，對腫瘤組織中Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，并將TLRs表達(dá)與超聲彈性成像（UE）特征進(jìn)行比較，探討二者之間的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑? Trizol試劑由北京奧維亞生物技術(shù)有限公司提供;逆轉(zhuǎn)錄試劑由北京億鳴聯(lián)創(chuàng)生物科技有限公司提供;PCR反應(yīng)試劑由上海諾晶生物科技有限公司提供，TLR1～TLR10以及GAPDH引物由上海生工合成;DMEM培養(yǎng)基由北京索萊寶科技有限公司提供;新生牛血清購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司;TLR兔抗人多克隆抗體由上海萬疆生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2 儀器? Alpha-1900Plus紫外分光光度儀購自上海譜元儀器有限公司;CAS IR GRID聚合酶鏈反應(yīng)儀由蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司提供，HI VISION Ascendus超聲診斷儀日本日立公司;Philips iu Elite超聲診斷儀荷蘭飛利浦公司。Toshiba Aplio XG 超聲診斷儀日本東芝公司;ABI-7000熒光定量PCR儀，美國ABI公司;LightCycler 480 II熒光定量PCR儀瑞士羅氏公司;Easypure uv/uf超純水制造儀美國BARNSTEAD公司;i Cycler PCR 擴(kuò)增儀由美國BIO-RAD公司提供;凝膠圖像分析系統(tǒng)（UVPGDS-8000）由美國 BIO-RAD 公司提供;穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（DYY-6B）由六一儀器廠（北京）提供;可調(diào)微量加樣器（Eppendprf）由德國Eppendprf公司提供。

1.2 標(biāo)本收集

研究數(shù)據(jù)采集期間收集牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院乳腺癌患者100例，均獲得最終手術(shù)病理結(jié)果，術(shù)前行常規(guī)超聲檢查，記錄病灶的大小（縱橫比）、形狀是否規(guī)則、邊界是否清晰、內(nèi)部有無小鈣化、后方伴或不伴回聲衰減等特點。研究時間為2016年12月～2017年12月，確保樣本的保存空間和溫度，避免受其他不良因素對樣本的影響。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)? MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞株均購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。采用10%胎牛血清RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液對MDA-MB-231進(jìn)行培養(yǎng)，采用10%胎牛血清及0.01 g/L牛胰島素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液對MCF-7進(jìn)行培養(yǎng)，在容量為50 mL培養(yǎng)瓶中接種，溫度設(shè)置為37℃，CO2濃度為5%，培養(yǎng)48 h后更換培養(yǎng)液，待其進(jìn)入對數(shù)生長周期予以收獲。

1.3.2 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄? 在1 mL Trizol中添加2.0×106個細(xì)胞，經(jīng)過分層、沉淀及洗滌后，半干后采用0.1% DEPC進(jìn)行水解，紫外分光光度儀設(shè)置為1.8～2.0，在-70℃環(huán)境下保存。行25 μL反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄，嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說明操作，將第一鏈cDNA保存在-20℃環(huán)境下。

1.3.3 普通PCR? 設(shè)置退火溫度55℃對TLT1-TLR10以及GAPDH水平予以檢測。2×PCR均為10 μmol/L上下游引物，各0.5 μL。cDNA為1 μL，循環(huán)參數(shù)：94℃5 min預(yù)變性，94℃ 30 s，55℃ 30 s，共循環(huán)35次，在72℃溫度下進(jìn)行5 min延伸。擴(kuò)增處理后給予空白對照，實驗均反復(fù)3次。在1.2%瓊脂糖凝膠中加入8 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，對成像結(jié)果予以觀察。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測? 本部分研究對于TLRs表達(dá)采取免疫組織化學(xué)進(jìn)行檢測。首先，將選取的新鮮活檢組織給予10.0%甲醛進(jìn)行固定，并采取梯度酒精進(jìn)行脫水處理，采取二甲苯透明和石蠟的包埋處理。將石蠟切片進(jìn)行HE染色，并且在每張切片滴加相應(yīng)對應(yīng)的一抗，最后進(jìn)行DAB顯色和蘇木精復(fù)染處理，并在顯微鏡下進(jìn)行觀察與判斷。見封三圖3。

1.3.5 Real-time PCR檢測TLRs mRNA表達(dá)量的變化? 本部分研究采用實時定量熒光PCR（Real-time PCR）法檢測乳腺癌組織中TLR3、TLR4、TLR5和TLR9 mRNA的水平情況。①RNA提取：取腫瘤組織，TRIzol勻漿后加入氯仿震蕩、離心，取上清，加入異丙醇，震蕩后離心，空氣干燥，測RNA濃度。②cDNA合成，取RNA，加入引物、反應(yīng)底物后，適宜條件下反應(yīng)，檢測cDNA。③以cDNA為模板，加入SYBGREEN和引物行PCR擴(kuò)增，檢測 TLRs mRNA水平變化。同時以管家基因葡萄糖磷酸脫氧酶作為內(nèi)參照，每份樣品均進(jìn)行3次重復(fù)檢測，取其平均CT值用于分析。

以上所有實驗均開展3次，選取平均值。用于比較不同的檢測指標(biāo)差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗;計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Cellquest軟件對流式數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測表達(dá)比較

MDA-MB-231當(dāng)中TLRs蛋白表達(dá)結(jié)果當(dāng)中比較高的依次是TLR4、TLR6、TLR7以及TLR5，而在MCF-7當(dāng)中TLR4和TLR6是蛋白表達(dá)水平最高的。見表1、圖1。

2.2 實時熒光定量PCR測定TLRs基因定量表達(dá)情況

乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中，TLR4表達(dá)為（25.67±1.12），是MCF-7的（12.22±1.40）倍（P<0.05），另外TLR6、TLR8及TLR9均顯著高于MCF-7對應(yīng)表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 細(xì)胞免疫熒光測定TLR4蛋白表達(dá)情況

計算20個視野平均值，得到MDA-MB-231細(xì)胞TLR4陽性細(xì)胞表達(dá)率為（86±4）%，顯著高于MCF-7的（51±7）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=19.415，P<0.01）。

3 討論

文獻(xiàn)報道，TLRs在天然免疫系統(tǒng)及小鼠、人類的腫瘤細(xì)胞中均呈廣泛表達(dá)[3]。現(xiàn)有研究證實人宮頸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞及胃癌細(xì)胞等均存在TLR4表達(dá)[4]。乳腺癌越早期發(fā)現(xiàn)、治療則預(yù)后較好，因此，早期診斷和治療具有重要意義。超聲檢查作為一種快捷、安全、無創(chuàng)的檢查方法，目前成為乳腺疾病診斷的主要手段之一，由于病灶的硬度與周圍正常組織往往不同，惡性腫瘤的病變組織自身較堅硬，并與附近組織粘連，硬度會更大[5-6]。彈性成像技術(shù)可通過檢測乳腺病灶與周圍組織的相對硬度從而輔助診斷乳腺病灶的良惡性[7]。炎癥因子的過度表達(dá)及慢性炎癥微環(huán)境適應(yīng)和促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、生長、血管形成和轉(zhuǎn)移，增加發(fā)展成惡性腫瘤的風(fēng)險[8]。TLRs是新近發(fā)現(xiàn)的參與非特異性免疫（天然免疫）的一類重要蛋白質(zhì)分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。其可營造炎癥微環(huán)境導(dǎo)致腫瘤形成，并在腫瘤形成基礎(chǔ)上促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[9-10]。

我們通過檢測乳腺癌患者腫瘤組織彈性與其TLR3、TLR4、TLR5和TLR9 mRNA的表達(dá)情況，探討其在研究對象腫瘤組織中表達(dá)的差異與腫瘤彈性變化的關(guān)系，旨在為乳腺癌的診治提供實驗診斷參考和療效評價標(biāo)準(zhǔn)。TLR4激活的信號通路與腫瘤的發(fā)展有密切的關(guān)系[11]。近年研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在很多腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)。TLR4信號途徑對前列腺癌的生長及轉(zhuǎn)移有著一定的促進(jìn)作用[12]。在TLR4及NF-κB依賴途徑下，細(xì)菌內(nèi)毒素LPS能夠激活尿激酶纖維蛋白溶酶，增強結(jié)直腸癌細(xì)胞黏附及侵襲能力[13]。

已有不少學(xué)者開展了Toll樣受體相關(guān)的內(nèi)容研究，如肖薔[14]分析了在乳腺癌細(xì)胞系當(dāng)中Pirh2、p53表達(dá)的意義，發(fā)現(xiàn)Pirh2、p53的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，王濤等[15]分析了Toll樣受體4活化增強乳腺癌細(xì)胞株MCF-7侵襲力的效果，發(fā)現(xiàn)脂多糖可增強MCF-7細(xì)胞株TLR4的表達(dá)，增強乳腺癌細(xì)胞的侵襲力。李娜等[16]分析缺氧誘導(dǎo)因子-2α在不同侵襲能力乳腺癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)及意義，發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子-2α可能與乳腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。唐樂輝等[17]則是研究了在乳腺癌當(dāng)中Toll樣受體在乳腺癌轉(zhuǎn)移機制當(dāng)中的作用，發(fā)現(xiàn)TRIF可能促進(jìn)乳腺癌的增殖、分化。除此之外，還有其他學(xué)者對Toll樣受體在乳腺癌組織中的表達(dá)結(jié)合青島地區(qū)開展研究，發(fā)現(xiàn)TLRs乳腺癌中高表達(dá)，TLR2可能增加青島地區(qū)女性患乳腺癌的風(fēng)險[18]。衛(wèi)文俊等[19]分析了TLR4在乳腺癌組織中的表達(dá)與微血管密度的關(guān)系及臨床意義，發(fā)現(xiàn)TLR4在乳腺癌組織中表達(dá)增高，可促進(jìn)新微血管的形成。張馨月等[20]也開展了Toll樣受體與乳腺癌、通路相關(guān)銜接蛋白之間的關(guān)系，為中醫(yī)藥抗乳腺癌的運用及明確其作用機制提供了實驗依據(jù)。這些均為研究理論的豐富奠定了堅實的基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-231及MCF-7均存在TLR1～TLR10在mRNA中表達(dá)。乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中，TLR4、TLR5及TLR6高表達(dá)，而MCF-7中TLR5高表達(dá)。經(jīng)實時熒光定量PCR測定發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的TLR4、TLR6、TLR8及TLR9均高于MCF-7。在蛋白質(zhì)水平上，MDA-MB-231當(dāng)中TLRs蛋白表達(dá)結(jié)果當(dāng)中比較高的依次是TLR4、TLR6、TLR7以及TLR5，而在MCF-7當(dāng)中TLR4和TLR6是蛋白表達(dá)水平較高，與mRNA水平基本一致。表明TLR4與TLR6是2株細(xì)胞間差異較大的受體，而TLR4差異最明顯。TLR4與腫瘤的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，促進(jìn)了乳腺癌的生長、黏附及侵襲。另外，本研究中TLR1、TLR3～8、TLR10在2株細(xì)胞間差異表達(dá)，可能與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，參與其轉(zhuǎn)移過程。

此次研究發(fā)現(xiàn)TLRs的差異化表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力具有一定的相關(guān)性，且TLRs在乳腺癌轉(zhuǎn)移中具有重要的參與作用，該結(jié)論能夠為乳腺癌轉(zhuǎn)移機制研究提供借鑒。

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（收稿日期：2018-11-23）