HMGB1在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血中表達(dá)水平及臨床意義

李杰蘭 潘秀婷

【摘要】 目的：探討高遷移率族蛋白B1（HMGB1）在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）患者外周血中表達(dá)水平及臨床意義。方法：選取本院收治的52例URSA早孕婦女為觀察組，46例正常早孕婦女為對(duì)照組。比較兩組外周血輔助性T細(xì)胞17（Th17）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、Th17/Treg比值和相關(guān)指標(biāo)（HMGB1、IL-17、IL-6、TGF-β及IL-10）的表達(dá)水平，分析HMGB1與各指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果：觀察組外周血Th17細(xì)胞和Th17/Treg比值均高于對(duì)照組，Treg細(xì)胞低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;觀察組外周血HMGB1、IL-17、IL-6水平均高于對(duì)照組，TGF-β、IL-10水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;相關(guān)性分析顯示，HMGB1與IL-6、IL-17、Treg、Th7均呈正相關(guān)（P<0.05），HMGB1與TGF-β、IL-10均呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：URSA患者外周血HMGB1水平增高，其可能通過影響Th17/Treg平衡參與URSA的發(fā)病。

【關(guān)鍵詞】 高遷移率族蛋白B1; 不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn); Th17/Treg; 臨床意義

【Abstract】 Objective：To investigate the expression level and its clinical significance of HMGB1 in peripheral blood of patients with unexplained recurrent spontaneous abortion（URSA）.Method：A total of 52 cases of early pregnant women with URSA were selected as observation group and 46 cases of normal early pregnant women as control group.The expression levels of helper T cell 17（Th17），regulatory T cell（Treg），Th17/Treg ratio and related indicators（HMGB1，IL-17，IL-6，TGF-β and IL-10）in peripheral blood of two groups were compared，and the correlation between HMGB1 and other indicators was analyzed.Result：The level of Th17 cells and Th17/Treg ratio in peripheral blood of observation group were higher than those of control group，the Treg cells was lower than that of control group，the differences were statistically significant（P<0.05）.The levels of HMGB1，IL-17 and IL-6 in peripheral blood of observation group were higher than those of control group，the levels of TGF-β and IL-10 were lower than those of control group，the differences were statistically significant（P<0.05）.The correlation analysis showed that HMGB1 was positively correlated with IL-6，IL-17，Th7 and Treg cells（P<0.05），while HMGB1 was negatively correlated with TGF-β and IL-10（P<0.05）.Conclusion：The increase of HMGB1 level in peripheral blood of URSA patients may be involved in the pathogenesis of URSA by affecting Th17/Treg balance.

【Key words】 High mobility group protein B1; Unexplained recurrent spontaneous abortion; Th17/Treg; Clinical significance

First-authors address：The Fourth Peoples Hospital of Nanhai，F(xiàn)oshan 528211，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.07.020

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA）是指連續(xù)2次或更多次的自然流產(chǎn)，其發(fā)生病因很復(fù)雜，除了生殖道解剖異常的原因，染色體異常、內(nèi)分泌異常和自身免疫疾病外，還未發(fā)現(xiàn)其他導(dǎo)致流產(chǎn)的原因，稱為同種免異型，也可稱為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）[1-2]。相關(guān)證據(jù)表明，不明原因的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)可能與免疫因素有關(guān)，而母體胎兒免疫耐受是一種重要的免疫因子，占50%～70%[3]。國(guó)內(nèi)外許多研究發(fā)現(xiàn)，高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種強(qiáng)有力的促炎因子和炎癥介質(zhì)，HMGB1通過與細(xì)胞表面受體結(jié)合的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)展[4-6]。因此，本文旨在探討URSA是否參與到HMGB1的發(fā)生，通過分析HMGB1在URSA患者外周血中的表達(dá)水平，以為URSA的臨床診斷和治療效果提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年8月-2016年7月本院收治的52例URSA早孕婦女為觀察組。診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者連續(xù)2次或更多次自然流產(chǎn)，無死產(chǎn)、活產(chǎn)史;檢查后沒有與流產(chǎn)有關(guān)的常見發(fā)現(xiàn)原因[7]。納入標(biāo)準(zhǔn)：既往無自然流產(chǎn)史;月經(jīng)周期規(guī)律;年齡25～45歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：甲狀腺功能異常、妊娠者;自身免疫性疾病者;低纖維蛋白血癥及血小板增多癥。另選取同期46例正常早孕婦女為對(duì)照組，均無遺傳和自然流產(chǎn)史，無死胎或解剖和內(nèi)分泌異常，懷孕期間未發(fā)生生殖道感染。該研究由醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，患者均被告知并簽署治療同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑 儀器：CO2培養(yǎng)箱，Accuri C6型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），離心機(jī)。試劑：鼠抗人CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-APC、CD69-PE、IL-17和Foxp3-PE熒光抗體，PBMC細(xì)胞懸液、佛波醇、離子霉素、流式輔助試劑、RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基和同型對(duì)照試劑，破膜劑緩沖液。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢查 （1）標(biāo)本采集：抽取兩組次日清晨空腹靜脈血4 mL，然后在離心機(jī)中離心5 min，制備PBMC細(xì)胞懸液，最后貯存在冰箱中-20 ℃檢查。（2）采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法檢測(cè)血漿HMGB1表達(dá)水平，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，試劑盒購(gòu)于BD公司;（3）輔助性T細(xì)胞17（Th17）檢查：通過流式細(xì)胞術(shù)，在潔凈實(shí)驗(yàn)臺(tái)上消毒30 min，向離子霉素、佛波醇、助流劑和RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中加入150 μL靜脈血，將體積分?jǐn)?shù)孵育6 h。5% CO2培養(yǎng)箱取出細(xì)胞懸浮液，轉(zhuǎn)移到試管中，離心加入RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基和同種型對(duì)照試劑搖動(dòng)，在黑暗中培養(yǎng)30 min，加入透化緩沖液，除去上清液。然后用2 mL工作溶液離心。加入400 μL染色溶液，并使用Accuri C6流式細(xì)胞儀檢查Th17水平。（4）調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）檢測(cè)：取100 μL PBMC細(xì)胞懸液于試管中，加入CD4-FITC、CD25-APC振蕩，在黑暗中孵育20 min，用緩沖液洗滌，取出上清液，檢查機(jī)器。然后加入Foxp3-PE熒光抗體和同種型對(duì)照試劑，在4 ℃孵育40 min，加入2 mL透化緩沖液，用工作溶液洗滌兩次，將細(xì)胞重懸于細(xì)胞染色緩沖液中，用流式細(xì)胞儀檢查。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩組外周血中Th17、Treg細(xì)胞和Th17/Treg比例;比較兩組外周血中相關(guān)指標(biāo)表達(dá)（HMGB1、IL-17、IL-6、TGF-β、Th7及IL-10）;分析HMGB1與IL-6、IL-17、TGF-β、IL-10、Treg、Th7細(xì)胞因子的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 23.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn);相關(guān)性采用Pearson直線相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較 兩組一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

2.2 兩組外周血中Th17、Treg細(xì)胞和Th17/Treg比例比較 觀察組外周血Th17細(xì)胞和Th17/Treg比值均高于對(duì)照組，Treg細(xì)胞低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3 兩組外周血中相關(guān)指標(biāo)表達(dá)比較 觀察組外周血HMGB1、IL-17、IL-6水平均高于對(duì)照組，TGF-β、IL-10水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.4 HMGB1與IL-6、IL-17、TGF-β、IL-10、Treg、Th17的相關(guān)性分析 相關(guān)性結(jié)果顯示：HMGB1與IL-6、IL-17、Treg、Th17均呈正相關(guān)（P<0.05），HMGB1與TGF-β、IL-10均呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），見表4。

3 討論

據(jù)報(bào)道，由于近一半的RSA患者原因尚不清楚，治療效果不理想，使其成為臨床上難治性不孕的原因[8]。因此，如何做好URSA患者外周血中表達(dá)及臨床意義已成為生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問題[9-11]。近年來，隨著生殖免疫學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，URSA的基礎(chǔ)研究和臨床診斷得到了很大的改善[12]。眾所周知，URSA是非常有害的，因此探討其病因是生殖領(lǐng)域一項(xiàng)重要研究。

HMGB1是一種核蛋白，以其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移力而得名。于1999年首次發(fā)現(xiàn)，釋放到細(xì)胞外介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，作為局部和全身炎癥性疾病中的重要炎癥細(xì)胞因子[13-15]?？赡苁侵委煾鞣N疾病的新靶點(diǎn)，還可能影響機(jī)體細(xì)胞免疫功能，引發(fā)感染后免疫功能紊亂。HMGB1在細(xì)胞核中的主要功能是與DNA結(jié)合。通過與各種轉(zhuǎn)錄因子，復(fù)制蛋白和類固醇受體相互作用，為了參與DNA復(fù)制、重組、修復(fù)和轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞外HMGB1表達(dá)水平與免疫炎癥密切相關(guān)。這表明HMGB1的這種性質(zhì)在其炎癥中起重要作用[16-17]。

本研究結(jié)果顯示，觀察組外周血Th17細(xì)胞和Th17/Treg均高于對(duì)照組，Treg細(xì)胞低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示URSA患者Th17和T細(xì)胞的表達(dá)明顯改變，但觀察組Th17/Treg高于對(duì)照組，對(duì)維持母體與胎兒間免疫耐受和良好的妊娠結(jié)局具有重要意義。以往研究表明Th17細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞亞群，Treg細(xì)胞主要來源于胸腺。兩者之間的平衡對(duì)于維持正常和穩(wěn)定的免疫狀態(tài)是必要的[18-20]。本研究結(jié)果顯示，觀察組外周血HMGB1、IL-17、IL-6水平均高于對(duì)照組，TGF-β、IL-10水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;其中HMGB1與IL-6、IL-17、Treg、Th7均呈正相關(guān)（P<0.05），提示HMGB1可促進(jìn)炎癥因子的釋放;HMGB1與TGF-β、IL-10均呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），提示HMGB1可通過作用于TGF-β和IL-10細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫抑制性。上述這些結(jié)果提示，HMGB1的直接或間接調(diào)節(jié)可能是由于Th17和Treg細(xì)胞免疫功能障礙的作用，從而影響URSA患者的Th17/Treg平衡。

綜上所述，URSA患者外周血HMGB1水平增高，其可能通過影響Th17/Treg平衡參與URSA的發(fā)病。

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（收稿日期：2018-08-15） （本文編輯：董悅）