非肥胖性糖尿病小鼠干眼模型的初步建立

崔 紅，李春華，李正日，李承霖，金海燕，任 寧，汝新宇，李英俊

0引言

糖尿病是一種復(fù)雜的慢性全身性疾病，是20～74歲人群中最常見的主要致盲原因之一，已成為發(fā)展中國家和發(fā)達國家日益嚴重的公共社會問題[1-2]。糖尿病可引起多種眼部并發(fā)癥，如糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病性角膜病變、代謝性白內(nèi)障等，其中糖尿病引起的干眼癥問題占15%～33%，近幾年成為研究熱點[3]。干眼癥發(fā)病機制復(fù)雜，選擇合適的動物模型是實驗研究的關(guān)鍵。非肥胖性糖尿病(non-obese diabetic，NOD)小鼠類似人類1型糖尿病發(fā)病特征[4-5]，因其可自發(fā)糖尿病，常作為自身免疫性糖尿病小鼠模型，用來研究糖尿病相關(guān)并發(fā)癥，如糖尿病腎病等。而國內(nèi)未見將其作為糖尿病性干眼模型的報道，本研究初步探討NOD小鼠作為糖尿病性干眼模型的可行性，并就其眼表變化情況進行初步討論，為以后糖尿病性干眼的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料選取40只清潔級雌性NOD/LtJ小鼠，均購自美國Jackson實驗室。鼠齡12wk，體質(zhì)量20～25g，無特定病原體，恒溫22℃、濕度55%環(huán)境下正常進食飼養(yǎng)。該實驗嚴格遵循動物實驗中實驗動物保護和倫理學(xué)要求。

1.2方法

1.2.1 NOD小鼠糖尿病模型的建立鼠齡12wk開始每周檢測尿糖2次，發(fā)現(xiàn)尿糖強陽性后用血糖儀測血糖，連續(xù)2次血糖≥16.7mmol/L診斷為糖尿病。NOD小鼠被診斷為糖尿病作為實驗組，同時選用未自發(fā)糖尿病的同齡NOD小鼠作為正常對照組。

1.2.2 NOD小鼠糖尿病性干眼模型的建立將實驗組NOD小鼠置于40%以下濕度環(huán)境，每天皮下注射0.5mg/0.2mL氫溴酸菪胺，并置于可控干燥箱中，每天通風(fēng)12h，制作蒸發(fā)過強型干眼模型。

1.2.3實驗分組NOD小鼠隨機分為2組：(1)正常對照組：20只未自發(fā)糖尿病的NOD小鼠。(2)實驗組：干眼1d組：5只糖尿病性干眼模型復(fù)制成功后第1d組；干眼7d組：5只糖尿病性干眼模型復(fù)制成功后第7d組；干眼10d組：5只糖尿病性干眼模型復(fù)制成功后第10d組；干眼14d組：5只糖尿病性干眼模型復(fù)制成功后第14d組。

1.2.4淚液分泌測定采用酚紅棉線試驗測量兩組小鼠淚液的分泌量，不同時間點各選用5只小鼠，分別選取右眼進行測定。在裂隙燈下，用眼科顯微鑷夾酚紅棉線，置于小鼠下結(jié)膜囊中外1/3，60s后取出，顯微鏡采用游標(biāo)卡尺觀察棉線濕潤長度，讀數(shù)精確到0.2mm，淚液分泌<5.0mm為低分泌。每組檢查后記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5結(jié)膜印跡細胞學(xué)檢查不同時間點每組各選取5只小鼠，用頸椎脫臼法處死。用硝酸纖維膜印取每只小鼠的右眼結(jié)膜，將其貼于載玻片上并固定，進行過碘酸雪夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色，使用透明液(10%乙醇∶冰醋酸=7∶3體積比)對纖維膜進行透明，載片鏡檢觀察結(jié)膜上皮細胞和杯狀細胞改變情況，計數(shù)穹窿結(jié)膜杯狀細胞數(shù)目。鏡檢、計數(shù)由同一專業(yè)人員進行，采用單盲法。

圖1小鼠糖尿病性干眼模型組和正常對照組的不同時間點淚液分泌量Baseline：NOD小鼠形成糖尿病干眼模型前的淚液分泌量值。

1.2.6角膜組織病理學(xué)檢查頸椎脫臼法處死小鼠，每組各選取5只小鼠，取右眼角膜并經(jīng)中央切開，投入4%多聚甲醛固定。常規(guī)石蠟包埋切片，采用蘇木精染色檢查，觀察角膜上皮變化情況。

2結(jié)果

2.1各組小鼠淚液分泌結(jié)果正常對照組與實驗組在第1、7、10、14d時的淚液分泌量情況見表1和圖1。對兩個實驗因素“分組”“時間”以及分組和時間的交互作用進行分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=9233.79，F(xiàn)時間=626.42，F(xiàn)組間×?xí)r間=628.16，均P<0.001)。在造模后的第1、7、10、14d，淚液分泌量較正常對照組均減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，且從造模后第1d開始，隨造模時間延長，實驗組的淚液分泌量隨時間而逐漸減少，于14d時淚液分泌量達到最低，而正常對照組在不同時間點的淚液分泌量未有明顯變化。

2.2各組小鼠結(jié)膜印跡細胞學(xué)檢查結(jié)果正常對照組的NOD小鼠結(jié)膜細胞小而圓，數(shù)量多，連接緊密，杯狀細胞核圓，胞質(zhì)易辨認，上皮細胞與杯狀細胞比約1∶1以上。建立糖尿病性干眼模型第1d，結(jié)膜細胞變大，細胞間距較正常對照組增大，核漿比減小，杯狀細胞數(shù)量明顯減少，上皮細胞與杯狀細胞比約2∶1以上。第7d，杯狀細胞數(shù)量極少，核質(zhì)比率=1/5。第10d，結(jié)膜細胞鱗狀化生化占結(jié)膜細胞1/2。第14d結(jié)膜細胞呈重度鱗狀化生化(圖2)。

2.3各組小鼠結(jié)膜杯狀細胞密度比較對兩個實驗因素“分組”“時間”以及分組和時間的交互作用進行分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=408.15，F(xiàn)時間=38.57，F(xiàn)組間×?xí)r間=14.62，均P<0.001，表2)。在造模后的第1、7、10、14d，杯狀細胞密度較正常對照組均減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；從造模后第1d開始，隨造模時間延長，實驗組杯狀細胞數(shù)量逐漸減少；而正常對照組在不同時間點的杯狀細胞數(shù)量未有明顯變化。

2.4各組小鼠角膜蘇木精染色結(jié)果正常對照組和糖尿病性干眼模型第10d組角膜病理切片見圖3。正常對照組角膜病理切片可見5層角膜上皮細胞，形態(tài)清晰、排列緊密。實驗組角膜上皮層變薄，部分上皮細胞變性，部分基底細胞水腫。

圖2各組小鼠結(jié)膜印跡細胞學(xué)檢查(過碘酸-希夫染色×200)A：正常對照組；B：干眼1d組；C：干眼7d組；D：干眼10d組；E：干眼14d組。

圖3各組小鼠角膜病理切片(蘇木精染色×200)A：正常對照組；B：干眼10d組。

分組基礎(chǔ)值第1d第7d第10d第14d正常對照組6.62±0.076.50±0.096.58±0.106.49±0.056.68±0.10實驗組6.48±0.213.82±0.07a2.52±0.08a3.26±0.15a2.22±0.05at1.39751.48174.75146.47690.106P0.200<0.001<0.001<0.001<0.001

注：基礎(chǔ)值：NOD小鼠形成糖尿病干眼模型前的淚液分泌量值；aP<0.05vs同一時間點對照組。

表2 各組小鼠結(jié)膜杯狀細胞密度比較 個/cm2)

注：aP<0.05vs同一時間點對照組。

3討論

糖尿病引起的并發(fā)癥可累及全身各個系統(tǒng)及器官，其中糖尿病相關(guān)性眼病是其中一個主要并發(fā)癥[6]，包括糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病性角膜病變、代謝性白內(nèi)障等。近年來，糖尿病并發(fā)的干眼癥問題因其對眼表的損害可造成視力下降而引起廣泛關(guān)注[7]。動物模型實驗是進行糖尿病性干眼研究必不可少的環(huán)節(jié)，選擇合適的動物模型是實驗研究的關(guān)鍵。目前，國內(nèi)1型糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥的研究大多采用左脲鏈霉素(streptozocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病動物模型，但該模型并沒有完全模擬出1型糖尿病發(fā)病的免疫機制，且常有自愈傾向，不利于長期觀察。而NOD小鼠是一種廣泛使用的研究1型糖尿病的動物模型[8]，其自發(fā)性糖尿病發(fā)病率較高，且雌性小鼠更易患病。

干眼癥發(fā)病機制復(fù)雜，主要包括淚膜不穩(wěn)定、淚液滲透壓升高、眼表炎癥和損害以及神經(jīng)感覺異常[9]，根據(jù)病因不同可分為淚液分泌不足型干眼和蒸發(fā)過強型干眼。NOD小鼠因其器官特異性自身免疫的特性可使淚腺發(fā)生自身免疫性病變[10]，使得NOD小鼠成為研究干眼癥的合適模型。然而，NOD小鼠是否適合建立糖尿病性干眼模型，在國內(nèi)未曾報道。本實驗選取雌性NOD/LtJ品系小鼠(均購自美國Jackson實驗室)，將實驗組小鼠置于40%以下濕度環(huán)境，每天皮下注射0.5mg/0.2mL氫溴酸菪胺，并置于可控干燥箱中，每天通風(fēng)12h，制作蒸發(fā)過強型干眼模型，這也符合臨床干眼癥發(fā)病的病理生理過程。

本研究中，通過對兩組NOD小鼠進行淚液分泌量測定、結(jié)膜印跡細胞學(xué)形態(tài)檢查、結(jié)膜杯狀細胞密度數(shù)測定和角膜病理切片染色，比較兩組小鼠的眼表情況，以初步探討NOD小鼠作為糖尿病性干眼模型的可行性。本實驗采用酚紅棉線測量淚液分泌量，結(jié)果顯示實驗組NOD小鼠的淚液分泌量在不同時間點較正常對照組減少，并且從建立糖尿病性干眼模型的第1～14d，實驗組淚液分泌量逐漸減少并達到最低值，由此可知實驗組小鼠淚液分泌量隨造模時間逐漸減少。有研究表明，淚膜穩(wěn)定性可受角結(jié)膜細胞成分、結(jié)膜炎癥狀態(tài)與增生情況所影響[11]，并且結(jié)膜杯狀細胞具有維持眼表穩(wěn)定性等作用，當(dāng)結(jié)膜杯狀細胞密度降低時，引起眼表黏蛋白分泌減少，淚膜穩(wěn)定性與功能性也就變差[12]，是反映眼表健康的重要指標(biāo)。本實驗采用PAS染色方法對兩組小鼠結(jié)膜杯狀細胞進行檢查與計數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常對照組小鼠結(jié)膜細胞小而圓，數(shù)量多，連接緊密，杯狀細胞核圓，胞質(zhì)易辨認，實驗組結(jié)膜杯狀細胞數(shù)量不斷減少、體積變大，結(jié)膜細胞不斷向鱗狀上皮化生。在不同時間點，實驗組小鼠結(jié)膜杯狀細胞數(shù)量較正常對照組均減少。我們還發(fā)現(xiàn)，從造模第1d開始，實驗組杯狀細胞密度隨著造模時間而逐漸降低，而正常對照組在不同時間點上未有明顯變化?？梢奛OD小鼠建立蒸發(fā)過強型干眼模型，可表現(xiàn)為眼表淚液分泌量減少，結(jié)膜杯狀細胞數(shù)目減少，結(jié)膜細胞變大且鱗狀上皮化，而杯狀細胞密度隨著造模時間逐漸減低的原因可能與干眼的嚴重程度有關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)[13]，干眼癥患者角膜上皮厚度是變薄的，同時當(dāng)淚液分泌不足或者眼表蒸發(fā)過強時可導(dǎo)致淚膜厚度降低。本實驗采用蘇木精染色觀察角膜病理組織切片，結(jié)果顯示實驗組小鼠角膜上皮層變薄，部分上皮細胞變性，部分基底細胞水腫，這些發(fā)現(xiàn)與臨床上干眼癥表現(xiàn)是一致的[14]。由此我們可推測，NOD小鼠眼表損害不斷加重使其角膜上皮完整性被不斷破壞，而臨床上角膜上皮點狀著色可能與其有關(guān)。

綜上所述，本實驗初步建立了NOD小鼠干眼模型，該模型可操作性強、重復(fù)性好，采用淚液分泌量測定、結(jié)膜組織PAS染色、角膜上皮蘇木精染色等方法顯示，其眼表變化與臨床上干眼癥表現(xiàn)類似。但本研究仍有不足之處，所選取小鼠樣本少，且本實驗?zāi)Ｐ蛢H是初步建立，其可行性與科學(xué)性還需有大量實驗去驗證。