兩種方法建立樹(shù)鼩骨質(zhì)疏松模型的比較實(shí)驗(yàn)研究

武羽潔 袁 鑫 角建林 吳 超 鄭 紅 唐 薇

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是一種由于骨量低下，骨微結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病，其中患者多為絕經(jīng)后女性，已被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為十大最嚴(yán)重疾病之一[1]。女性絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平下降,骨量流失加速,導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換加快、骨組織退化以及骨密度的較低,大大提高女性骨質(zhì)疏松的發(fā)生率,不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,還對(duì)患者的生命安全存在極大的安全隱患[2,3]。

樹(shù)鼩(tree shrew)是一種形似松鼠的雜食動(dòng)物，廣泛分布于東南亞的大部分地區(qū)，包括印度和中國(guó)南部[4]。樹(shù)鼩在進(jìn)化過(guò)程中處于食蟲(chóng)目與靈長(zhǎng)目之間，接近靈長(zhǎng)類的小型哺乳動(dòng)物，由于其具有體形小、腦體質(zhì)量比高、易馴化飼養(yǎng)、繁殖周期短、壽命較長(zhǎng)等特點(diǎn)，在生化代謝、生理機(jī)制、大體解剖和基因組等方面接近于人類，是潛在可能替代靈長(zhǎng)類的一種新型、極具價(jià)值和科學(xué)研究需求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[5]。WHO鼓勵(lì)用樹(shù)鼩代替日益瀕危的靈長(zhǎng)目動(dòng)物進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物模型是開(kāi)展OP科研工作的有效工具, 建立理想的動(dòng)物模型對(duì)于探尋OP的發(fā)病機(jī)制以及研發(fā)治療OP的新方法和新藥物等具有重要意義[6]。

卵巢的功能主要是排卵及分泌性激素。參與生育功能及維持月經(jīng)、對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌和全身的某些代謝也起到十分重要的調(diào)節(jié)作用，卵巢產(chǎn)生的雌激素在骨質(zhì)代謝中也有重要作用。近年來(lái)研究表明,子宮不僅是一個(gè)受激素作用的靶器官, 而且還能分泌泌乳素、胰島素生長(zhǎng)因子、松弛素、上皮因子、內(nèi)皮素及細(xì)胞因子、酶等多種生物活性物質(zhì), 與卵巢、垂體進(jìn)行精細(xì)的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)[7]。Waston等[8]進(jìn)行嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì), 結(jié)果子宮切除患者盡管保留了雙側(cè)卵巢, 仍有明顯的骨密度下降。田杰等[9]研究不同術(shù)式子宮切除術(shù)對(duì)患者骨代謝影響時(shí)發(fā)現(xiàn)患者切除子宮后骨轉(zhuǎn)換加快, 骨吸收大于骨形成, 長(zhǎng)期骨代謝處于負(fù)平衡狀態(tài)易導(dǎo)致繼發(fā)性的骨質(zhì)疏松。上述研究表明，子宮和卵巢都是影響骨質(zhì)量的重要因素。去卵巢大鼠模型是一種高轉(zhuǎn)換型OP模型，已被公認(rèn)為“金標(biāo)準(zhǔn)”模型，但去卵巢法能否建立樹(shù)鼩OP模型以及效果如何，猶未可知[10]。本研究分析對(duì)比了去卵巢和去卵巢子宮兩種去勢(shì)方法建立雌性樹(shù)鼩OP動(dòng)物模型的效果，為后續(xù)的研究工作提供一定的理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：45只滇西亞種樹(shù)鼩，雌性，體質(zhì)量120±10g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，普通級(jí)。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(滇)2015-0002。

2.儀器與試劑：雙能X線骨密度儀(型號(hào)：Prodigy,美國(guó)GE公司)；電子天平(型號(hào)：YP2001N，上海精密科學(xué)儀有限公司)；3%戊巴比妥鈉(由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

3.分組：將45只雌性樹(shù)鼩分為3組，即正常組15只，去卵巢組15只，去卵巢子宮組15只。

4.建模：雌性樹(shù)鼩用3%戊巴比妥鈉(1ml/kg)麻醉后，分別在下腹部?jī)蓚?cè)各剪一個(gè)約1cm的開(kāi)口，去卵巢組樹(shù)鼩切除雙側(cè)卵巢，去卵巢子宮組樹(shù)鼩切除雙側(cè)卵巢+子宮，在傷口處涂撒適量青霉素后縫合。造模期間的前3天，青霉素肌內(nèi)注射2×105U/只，預(yù)防感染。

5.稱量樹(shù)鼩體質(zhì)量：術(shù)后3、6、9個(gè)月，利用電子天平，稱量各組樹(shù)鼩體質(zhì)量。

6.檢測(cè)樹(shù)鼩BMD、BMC：術(shù)后3、6、9個(gè)月，采用雙能X線骨密度儀，將麻醉的樹(shù)鼩水平置于平臺(tái)上，空氣校準(zhǔn)后，分別對(duì)各組樹(shù)鼩進(jìn)行全身性掃描，獲得雙能X線骨掃描圖像，采用小動(dòng)物骨密度分析軟件，可獲得樹(shù)鼩全身的BMD及BMC。

結(jié) 果

1.體質(zhì)量變化情況：3組樹(shù)鼩體質(zhì)量隨時(shí)間變化情況詳見(jiàn)圖1，3組樹(shù)鼩體質(zhì)量均逐漸增加，但去卵巢組及去卵巢子宮組體重增加幅度比正常組大。在第6個(gè)月時(shí)，去卵巢組以及去卵巢子宮組樹(shù)鼩體質(zhì)量高于正常組樹(shù)鼩，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在第9個(gè)月時(shí)，去卵巢子宮組樹(shù)鼩體質(zhì)量高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組體質(zhì)量變化情況
與正常組比較，*P<0.05

2.全身骨密度變化情況：在建模后第3個(gè)月時(shí)，去卵巢組及去卵巢子宮組樹(shù)鼩全身骨密度顯著低于正常組(P<0.01)；且去卵巢子宮組樹(shù)鼩全身骨密度低于去卵巢組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后第6個(gè)月和第9個(gè)月，去卵巢組及去卵巢子宮組樹(shù)鼩全身骨密度顯著低于正常組(P<0.01)；且去卵巢子宮組樹(shù)鼩全身骨密度低于去卵巢組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在術(shù)后第6個(gè)月時(shí)，去卵巢組及去卵巢子宮組樹(shù)鼩骨密度下降率最大，分別為18.77%和26.65%，詳見(jiàn)表1和圖2。

表1 兩種去勢(shì)法對(duì)骨密度下降率的比較(%)

圖2 各組樹(shù)鼩全身骨密度變化情況
與正常組比較，*P<0.01；與去卵巢組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.全身骨礦鹽含量變化情況：去卵巢組與正常組樹(shù)鼩骨礦鹽含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；去卵巢子宮組樹(shù)鼩骨礦鹽含量在術(shù)后第6個(gè)月時(shí)顯著低于正常組和去卵巢組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；術(shù)后第9個(gè)月時(shí)，各組樹(shù)鼩骨礦鹽含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)圖3。

圖3 各組樹(shù)鼩全身骨礦鹽含量變化情況
與正常組比較，*P<0.01；與去卵巢組比較，#P<0.01

討 論

骨質(zhì)疏松癥累及多數(shù)老年人, 尤其是絕經(jīng)后老年女性隨著年齡增長(zhǎng)、卵巢功能衰竭, 雌激素水平降低, 骨量流失會(huì)更加嚴(yán)重[11]。嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松癥可出現(xiàn)自發(fā)性骨折，危及患者的生活質(zhì)量。影響骨密度的原因很多，其中肥胖的因素越來(lái)越受到重視[12]。肥胖和骨質(zhì)疏松都是機(jī)體常見(jiàn)慢性病。肥胖是機(jī)體脂肪含量過(guò)多或分布異常所造成的一種病態(tài)表現(xiàn)，世界衛(wèi)生組織(WHO)將BMI>30kg/m2人群定義為肥胖。在中國(guó)隨著居民生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，肥胖的流行率逐漸增高，至2010年我國(guó)肥胖人口已達(dá)1.2億，肥胖及其相關(guān)慢性疾病已成為我國(guó)當(dāng)今重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題[13]。女性絕經(jīng)后，體內(nèi)激素及神經(jīng)內(nèi)分泌環(huán)境波動(dòng)較男性顯著，在特定時(shí)期易于出現(xiàn)體脂的沉積或再分布。主要是由于成年向老年過(guò)渡階段內(nèi)分泌暫時(shí)紊亂、雌激素分泌減少而腎上腺皮質(zhì)功能代償性亢進(jìn)，糖皮質(zhì)激素分泌增多而促進(jìn)脂肪吸收和儲(chǔ)存。另一方面，隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體各系統(tǒng)器官趨于衰退，細(xì)胞代謝緩慢，消耗能量也趨于減少，再加上運(yùn)動(dòng)量減少、營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩等從而造成肥胖[14]。本研究采用去卵巢法和去卵巢子宮法建立樹(shù)鼩OP模型，在建模第6個(gè)月去卵巢組和去卵巢子宮組樹(shù)鼩體質(zhì)量顯著高于正常組樹(shù)鼩，與女性絕經(jīng)后體質(zhì)量增加結(jié)果一致。

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的提出的診斷骨質(zhì)疏松癥的“金標(biāo)準(zhǔn)”是通過(guò)雙能X線骨密度儀測(cè)量BMD，當(dāng)BMD值≤正常年輕人2.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(T值≤-2.5)時(shí)，即可確診為骨質(zhì)疏松癥。BMD是直接對(duì)骨骼的量化診斷指標(biāo)，常用于診斷骨質(zhì)疏松癥，預(yù)測(cè)骨折風(fēng)險(xiǎn)和評(píng)定治療效果[15]。BMC是指被測(cè)量骨所含礦物質(zhì)的總量，亦是反應(yīng)骨質(zhì)量的重要指標(biāo)。本研究觀察到，去卵巢法和去卵巢子宮兩種去勢(shì)方法均能造成樹(shù)鼩BMD下降，且在術(shù)后第6個(gè)月出現(xiàn)最低谷。術(shù)后第6個(gè)月去卵巢組和去卵巢子宮組樹(shù)鼩BMD分別下降了18.77%、26.65%。去卵巢子宮組樹(shù)鼩BMC在第6個(gè)月顯著低于正常組和去卵巢組樹(shù)鼩。上述結(jié)果表明，采用去卵巢子宮法建立樹(shù)鼩OP模型效果更優(yōu)。

綜上所述，采用去卵巢子宮手術(shù)法建立樹(shù)鼩骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型更優(yōu)，且術(shù)后的第6個(gè)月為建模的最佳時(shí)期。