半胱亞磺酸脫羧酶在妊娠小鼠子宮和胚胎中的表達(dá)定位研究*

李 煒，呂釗旭，馮永珍，張淑芝，左語(yǔ)馨，范晶晶,5△

(1.濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院內(nèi)科教研室，山東濰坊 261041；2.山東省濰坊市婦幼保健院新生兒科 261000；3.濰坊學(xué)院校醫(yī)院護(hù)理部，山東濰坊 261061；4.濰坊學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東濰坊 261061；5.山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/濰坊學(xué)院，山東濰坊 261061)

哺乳動(dòng)物妊娠是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，成功的妊娠需要多種分子的協(xié)同作用，如類(lèi)固醇激素、特定生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、脂類(lèi)介質(zhì)、黏附分子和轉(zhuǎn)錄因子等[1]。近年來(lái)在胚胎自身和子宮內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)、小分子肽類(lèi)和一些氨基酸在妊娠過(guò)程中起十分重要的作用，其中?；撬岚l(fā)揮的作用逐漸引起人們的重視[2-3]。在哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)中牛磺酸是含量最豐富的游離氨基酸之一，并且在卵母細(xì)胞和著床前的胚胎中都有很高的含量[4-5]。體外培養(yǎng)條件下?；撬峥梢蕴岣咄谩⑿∈蠛拓i等動(dòng)物胚胎的桑葚胚率和囊胚率[6-8]。如果在妊娠和哺乳過(guò)程中缺乏?；撬?，后代就會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育停滯、畸形發(fā)育、視網(wǎng)膜退化、心肌損害和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)能紊亂等現(xiàn)象[9-10]。這些研究提示?；撬釋?duì)于妊娠過(guò)程子宮生理作用的正常發(fā)揮及胚胎的發(fā)育可能起到非常重要的作用。

?；撬岬亩喾N生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮依賴于它在細(xì)胞內(nèi)的濃度，細(xì)胞內(nèi)?；撬醽?lái)源主要有兩種：一種可以通過(guò)?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)體(TauT)從胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，另一種可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)含有的半胱亞磺酸脫羧酶(CSD)自身合成[11]。CSD是一種同源二聚體酶，屬于Ⅱ型脫羧酶家族，其底物為半胱亞磺酸，產(chǎn)物為二氧化碳和亞牛磺酸，現(xiàn)在一般認(rèn)為CSD是哺乳動(dòng)物生物合成牛磺酸的主要限速酶[12]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)和原位雜交的方法，直觀地研究CSD在妊娠早期小鼠子宮和胚胎的表達(dá)及定位情況，為研究CSD和?；撬嵩谌焉镒訉m發(fā)揮的生理功能及對(duì)胚胎發(fā)育的作用等奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑 采用8周齡昆明小鼠，控制溫度為25 ℃，自然光周期條件下飼養(yǎng)。取發(fā)情期雌鼠與雄鼠自然交配，采集妊娠第1～9天著床點(diǎn)與非著床點(diǎn)的子宮組織，4%多聚甲醛固定，用于免疫組織化學(xué)。第7天子宮著床點(diǎn)組織、第11天胚胎在10倍體積的4%多聚甲醛中4 ℃固定過(guò)夜，再放入30%蔗糖溶液中浸泡直至組織沉降，取第7天著床點(diǎn)組織用Tissue Tek OCT包埋用于原位雜交，第11天小鼠胚胎進(jìn)行全胚原位雜交。

CSD多抗由法國(guó)TAPPAZ教授(INSERM U 433)贈(zèng)送，堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔IgG(GAR-AP)、堿性磷酸酶標(biāo)記的地高辛抗體(anti-DIG-AP)購(gòu)自北京中杉金橋公司。Trizol、M-MLV購(gòu)自美國(guó)Promega公司。DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小提和大提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。地高辛標(biāo)記試劑盒(DIG Oligonucleotide 3′-End Labeling Kit)購(gòu)自瑞士Roche公司。pMD18-T DNA質(zhì)粒購(gòu)自日本TaKaRa公司。乙?；芤海?0 mL 1 mol/L TEA(pH 8.0)、90 mL焦碳酸二乙酯(DEPC)水、250 μL醋酸酐混勻。Solution B1溶液：100 mL 1 mol/L Tris pH 7.5和30 mL 5 mol/L NaCl用蒸餾水定容至1 L，滅菌室溫保存。NBT/BCIP顯色液：3.4 μL 100 mg/mL NBT，3.5 μL 50 mg/mL BCIP，2.4 μL 24 mg/mL 左旋咪唑，5.0 μL 10% Tween-20，986.0 μL NBT/BCIP顯色液。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色 將石蠟包埋好的子宮組織切成5 μm厚連續(xù)切片，找到著床點(diǎn)及胚胎進(jìn)行免疫組織化學(xué)。脫蠟，過(guò)梯度乙醇水化，0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù)，放置至室溫，羊血清封閉，按1∶1 000稀釋CSD抗體(一抗)滴加在組織上，放入濕盒4 ℃冰箱過(guò)夜。第2天洗掉一抗，加入GAR-AP(1∶200)，孵育2 h，NBT/BCIP顯色液顯色，封片，顯微鏡照相。陰性對(duì)照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，其他步驟完全相同。

1.2.2原位雜交

1.2.2.1探針制備 針對(duì)CSD基因(GeneBank序列號(hào)：144942.4)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)引物，正向引物序列為：5′-AGC ACC TCC TCT TCC ATG AG-3′，反向引物序列為：5′-GAT GGC TGA CTC AAA ACC AC-3′。RT-PCR擴(kuò)增目的基因，純化回收擴(kuò)增產(chǎn)物，將產(chǎn)物連接到pMD18-T DNA質(zhì)粒，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟參考文獻(xiàn)[13]方法，重組質(zhì)粒的酶切及PCR鑒定參考文獻(xiàn)[14]方法。酶切、鑒定純化的質(zhì)粒DNA分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ線性化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切片段。線性化后的質(zhì)粒用DNA凝膠回收試劑盒回收，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定線性化DNA濃度。純化后的探針使用地高辛標(biāo)記試劑盒進(jìn)行標(biāo)記。

1.2.2.2雜交方法 將包埋好的第7天子宮著床點(diǎn)組織切成10 μm厚的冰凍切片，室溫風(fēng)干30 min，4%四氟乙烯-全氟烷氧基乙烯基醚共聚物(PFA)固定10 min，PBS清洗5 min，乙?；芤禾幚?0 min，DEPC水清洗5 min，5 μg/mL蛋白酶K溶液處理5 min，PBS清洗5 min。預(yù)雜交液孵育4～8 h，然后用CSD探針雜交液(5 μg/mL)50 ℃孵育過(guò)夜。第2天清洗雜交液，牛血清封閉1 h，加anti-DIG-AP(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜。次日取出切片用Solution B1室溫清洗10 min，NBT/BCIP顯色液顯色，顯色結(jié)束終止反應(yīng)，70%甘油封片并照相。

第11天胚胎從4%多聚甲醛固定，取出，依次通過(guò)含100%、95%、75%、50%甲醇PBS溶液，然后放置于PBS中，用10 μg/mL蛋白酶K消化處理20 min，清洗后放入含有0.1%戊二醛的4%多聚甲醛溶液再固定20 min，PBS清洗后，放入65 ℃含有1 μg/mL探針的雜交液中過(guò)夜。次日清洗雜交液，用20%胎牛血清封閉1 h，加anti-DIG-AP(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜。次日取出放入含1% 牛血清清蛋白(BSA)的PBS-Tween-20(PBST)中清洗，每2小時(shí)換液1次，PBST浸泡過(guò)夜。次日取出放入PBST中清洗2次，每次30 min，BM purple顯色液顯色，TE清洗終止顯色，解剖鏡下照相。正義鏈探針為陰性對(duì)照，原位雜交操作與反義鏈探針相同。

2 結(jié) 果

2.1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見(jiàn)圖1，藍(lán)色為CSD陽(yáng)性信號(hào)，分布在細(xì)胞質(zhì)中。在妊娠第1、2天子宮中CSD主要定位在子宮腔上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞，而第3、4天大量子宮基質(zhì)細(xì)胞也表現(xiàn)出較強(qiáng)的CSD陽(yáng)性。第6天開(kāi)始胚胎周?chē)淖訉m蛻膜細(xì)胞不表達(dá)CSD，但貼近子宮系膜緣和系膜對(duì)側(cè)緣均高表達(dá)CSD。第8天開(kāi)始子宮CSD的表達(dá)明顯減弱，第9天表達(dá)更弱，只有系膜對(duì)側(cè)緣子宮CSD呈中等程度陽(yáng)性反應(yīng)。在第9天著床點(diǎn)間的子宮CSD主要定位在腔上皮和腺上皮細(xì)胞。第4天子宮中的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞都表達(dá)CSD，到第9天胚胎都有CSD陽(yáng)性。陰性對(duì)照未檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)，見(jiàn)圖1。

le:腔上皮;ge：腺上皮；S：基質(zhì)；myo：子宮肌層；bl:囊胚；em：胚胎；M：系膜緣；Am：系膜對(duì)側(cè)緣；IS：著床點(diǎn)；Inter-IS：著床點(diǎn)之間的子宮(標(biāo)尺為20 μm)

圖1CSD在妊娠小鼠子宮中的免疫組織化學(xué)分布

em：胚胎；M：子宮系膜緣；Am：子宮系膜對(duì)側(cè)緣；IS：著床點(diǎn)；Inter-IS：著床點(diǎn)間的子宮(標(biāo)尺為100 μm)

圖2原位雜交檢測(cè)CSD的第7天胚胎和子宮定位

2.2原位雜交結(jié)果 第7天胚胎和著床點(diǎn)子宮中都能檢測(cè)到CSD mRNA陽(yáng)性信號(hào)，子宮系膜對(duì)側(cè)緣CSD陽(yáng)性表達(dá)明顯，胚胎周?chē)淖訉m蛻膜細(xì)胞未檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)。第7天CSD主要定位于腔上皮和腺上皮細(xì)胞，陰性對(duì)照未檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)。第11天CSD定位于腦、心臟、脊髓，見(jiàn)圖2、3。

Hb：后腦；T：端腦

圖3原位雜交檢測(cè)CSD的第11天胚胎定位

3 討 論

雌激素(E2)和孕激素(P4)是胚胎著床過(guò)程中最重要的兩種激素，E2主要刺激子宮腔上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞增殖，P4主要刺激子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞分化為蛻膜細(xì)胞[15]。本研究結(jié)果顯示CSD在第1～9天子宮的表達(dá)有一定的動(dòng)態(tài)變化，第1～2天主要定位在子宮腔上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞，第3天開(kāi)始子宮基質(zhì)細(xì)胞也出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。LOBO等[16]用免疫組織化學(xué)檢測(cè)到?；撬嵩诎l(fā)情后期、間情期大鼠子宮的腔上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞表達(dá)。子宮腔上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞具有分泌功能，其分泌物是子宮液的主要來(lái)源，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明子宮腔上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞可以通過(guò)CSD途徑自身合成?；撬岱置诘阶訉m液中發(fā)揮生理作用，并且可能與E2和P4對(duì)子宮細(xì)胞的增殖調(diào)控有關(guān)。妊娠第4～5天被稱為小鼠胚胎著床窗口期是妊娠最重要的一個(gè)時(shí)期，此時(shí)的胚胎要受到多種因子的復(fù)雜調(diào)控才能成功著床[1]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示從第3天開(kāi)始大量子宮基質(zhì)細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)CSD，CSD表達(dá)急劇增加說(shuō)明可能在著床窗口期子宮需要合成大量?；撬?，也有可能牛磺酸作為一種信號(hào)分子作用于子宮為接受胚胎做準(zhǔn)備。從第6天開(kāi)始胚胎周?chē)淖訉m蛻膜細(xì)胞中檢測(cè)不到CSD，第8天子宮CSD的反應(yīng)明顯減弱，第9天表達(dá)更弱，只有子宮系膜對(duì)側(cè)緣有微弱表達(dá)，胚胎從囊胚到第9天胚胎都有CSD陽(yáng)性。著床過(guò)程結(jié)束后子宮CSD表達(dá)開(kāi)始下降，可能是由于?；撬嵝枨罅繙p少或胚胎通過(guò)自身CSD合成的牛磺酸已經(jīng)能滿足發(fā)育的需要。CSD的表達(dá)模式說(shuō)明?；撬嵩谥步⒁院?，可能對(duì)胚胎正常發(fā)育起一定作用。

原位雜交顯示CSD第7天定位于著床點(diǎn)子宮和胚胎中，胚胎周?chē)淖訉m蛻膜細(xì)胞無(wú)表達(dá)。第11天定位于胚胎腦、心臟、脊髓。KIM等[17]采用RT-PCR方法也檢測(cè)到CSD mRNA在ICR小鼠胚胎發(fā)育第4、10、15、18天都有表達(dá)。STURMAN等[18]發(fā)現(xiàn)缺乏?；撬岬拇曝埳碌淖阍滦∝埫黠@比正常貓小，腦質(zhì)量明顯降低，腦形態(tài)異常。補(bǔ)充?；撬峥筛纳粕L(zhǎng)受限的胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[19]?；蚯贸；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白引起的牛磺酸耗竭會(huì)導(dǎo)致心肌萎縮和心肌病[20]。以上結(jié)果說(shuō)明在胎兒的心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等重要系統(tǒng)里是可以通過(guò)CSD途徑合成?；撬?，?；撬釋?duì)胚胎重要系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮一定作用。

綜上所述，CSD在妊娠小鼠子宮和胚胎中的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化，?；撬峥赡茉谂咛グl(fā)育和著床、調(diào)節(jié)妊娠子宮狀態(tài)中發(fā)揮一定的作用。?；撬嵩谂咛グl(fā)育過(guò)程中的作用及機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。