單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在自身免疫病的潛在應(yīng)用價(jià)值

李 璐，劉金晶，鄭文潔

作者單位:100730 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科風(fēng)濕免疫病學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA sequencing，RNA-seq) 分析逐漸成為一種常用的實(shí)驗(yàn)手段，但過去對(duì)于轉(zhuǎn)錄組的分析僅局限在群體細(xì)胞水平，由于常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析方法是對(duì)大量細(xì)胞測(cè)序分析得出的平均結(jié)果，或者反映的是數(shù)量占優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞數(shù)據(jù)，罕見細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄組特征則在平均化過程中被掩蓋，忽略了細(xì)胞之間或細(xì)胞亞型之間的異質(zhì)性。近年興起的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq) 是從單個(gè)細(xì)胞水平獲得全轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)譜，其原理是將分離的單個(gè)細(xì)胞的微量全轉(zhuǎn)錄組RNA 擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測(cè)序，利用該技術(shù)能夠揭示單個(gè)細(xì)胞內(nèi)整體水平的基因表達(dá)狀態(tài)和基因結(jié)構(gòu)信息，準(zhǔn)確反映細(xì)胞間的異質(zhì)性。2009年Tang等[1]首次報(bào)道了基于高通量測(cè)序的scRNA-seq 技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了芯片未檢測(cè)到5 200 多個(gè)基因和1 800個(gè)可變剪切點(diǎn)。隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)迅速發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用在多個(gè)領(lǐng)域，如干細(xì)胞發(fā)育和分化[2-5]、胚胎細(xì)胞[6]、腫瘤[7-8]、神經(jīng)[9-11]以及微生物[12]研究等各個(gè)方面。下文將主要對(duì)scRNA-seq技術(shù)的核心步驟和在自身免疫病研究中的應(yīng)用以及潛在應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行介紹。

1 scRNA-seq 核心技術(shù)及優(yōu)勢(shì)

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序主要包括以下4 個(gè)步驟:單細(xì)胞分離，單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和數(shù)據(jù)分析(圖1)。其中單細(xì)胞分離、單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是scRNA-seq 的核心技術(shù)。

圖1 scRNA-seq 技術(shù)路線Fig 1 scRNA-seq technical route

1.1 各種單細(xì)胞分離方法的優(yōu)劣

常用的單細(xì)胞分離方法主要有梯度稀釋法、顯微操作法、熒光激活細(xì)胞分選法、激光捕獲顯微切割法以及微流控平臺(tái)。梯度稀釋法雖然操作簡(jiǎn)單，但不能有效分選所需要的細(xì)胞亞群且容易發(fā)生錯(cuò)誤而導(dǎo)致細(xì)胞丟失。顯微操作法選擇精度高，但分離效率低，且容易對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械損傷，不適于規(guī)模化應(yīng)用。熒光激活細(xì)胞分選法是目前常用的分離單細(xì)胞的方法，該方法通過細(xì)胞的物理特性(如細(xì)胞大小、熒光散射度) 和特異性的分子標(biāo)記對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和分離，具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高通量的特點(diǎn)，但需要大量的起始細(xì)胞數(shù)，對(duì)于小樣本并不適用。激光捕獲顯微切割法可以快速、準(zhǔn)確地分離細(xì)胞且重復(fù)性好，但對(duì)組織切片的質(zhì)量要求較高。微流控平臺(tái)具有需要的樣本量較少，試劑損耗低，細(xì)胞污染率低，高通量的特點(diǎn)，可以廣泛推廣和應(yīng)用。每種方法各有利弊，需根據(jù)實(shí)際需求合理選擇。

1.2 單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增

與群體細(xì)胞提取核酸不同，單個(gè)細(xì)胞的核酸在皮克級(jí)別，要想達(dá)到核酸測(cè)序所需的核酸里量，需要高效的cDNA 擴(kuò)增方法。根據(jù)合成第二條cDNA鏈時(shí)使用的酶，可將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的cDNA 擴(kuò)增方法分為PCR 法 (如mRNA-Seq、Smart-Seq、Smart-Seq2、STRT-Seq 和SMA)、體外轉(zhuǎn)錄法(如CEL-Seq) 和Phi29 聚合酶法(如PMA)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

在某一特定階段，由細(xì)胞轉(zhuǎn)錄出來(lái)的全部RNA 稱之為轉(zhuǎn)錄組，包括信使RNA 和非編碼RNA。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序就是在單個(gè)細(xì)胞水平上對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序的一項(xiàng)技術(shù)，通常狹義上僅以mRNA 作為研究對(duì)象。單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)@得的轉(zhuǎn)錄本與參考基因組相比較，可以得到基因表達(dá)差異、可變剪接、融合基因等遺傳調(diào)控信息，發(fā)現(xiàn)亞細(xì)胞成分的基因表達(dá)譜，有助于全面理解細(xì)胞基因表達(dá)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的作用，連續(xù)追蹤基因表達(dá)的動(dòng)力學(xué)變化，從而監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展。

1.4 scRNA-seq 的優(yōu)勢(shì)

常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法是對(duì)所有細(xì)胞的混合樣本進(jìn)行測(cè)序分析，其結(jié)果是所有細(xì)胞測(cè)序結(jié)果的平均值，或反映的是數(shù)量占優(yōu)勢(shì)細(xì)胞的數(shù)據(jù)，少數(shù)細(xì)胞的異質(zhì)性在平均化過程中被掩蓋，對(duì)于揭示單個(gè)細(xì)胞間的異質(zhì)性存在明顯的缺陷。而scRNA-seq 技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)是可以對(duì)組織中單個(gè)細(xì)胞分別進(jìn)行研究，明確單個(gè)細(xì)胞間基因表達(dá)異質(zhì)性，獲得更多樣本信息，對(duì)揭示細(xì)胞來(lái)源、功能起著關(guān)鍵作用。除此之外，對(duì)于早期胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞和循環(huán)腫瘤細(xì)胞等低樣本獲取量細(xì)胞，常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序因細(xì)胞數(shù)量的限制已不再適用。但scRNA-seq 技術(shù)可以很好地解決樣本低獲取量的問題，數(shù)百至數(shù)千個(gè)細(xì)胞即可滿足測(cè)序需求，樣本獲取量靈活。

2 在自身免疫病中的應(yīng)用

scRNA-seq 技術(shù)最初被用于哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育階段[3]的轉(zhuǎn)錄組分析，隨著技術(shù)的不斷成熟，應(yīng)用范圍擴(kuò)大到干細(xì)胞發(fā)育和分化[4]、組織器官發(fā)育[13]、微生物[14]、腫瘤[15]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[16]和自身免疫系統(tǒng)疾病[17]等多個(gè)領(lǐng)域(表1)。自身免疫性疾病病種多樣，且發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，各種免疫細(xì)胞在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。scRNA-seq 技術(shù)可以在單細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)新的免疫細(xì)胞亞群，確定基因表達(dá)異質(zhì)性并發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞分化、發(fā)育規(guī)律，為自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制、治療的研究提供新方法。

表1 scRNA-seq 技術(shù)在各領(lǐng)域的應(yīng)用Table 1 Application of scRNA-seq technique in various fields

2.1 scRNA-seq 在確定新型細(xì)胞亞群中的應(yīng)用

2.1.1 樹突細(xì)胞:根據(jù)細(xì)胞表型和功能差別，外周血中樹突細(xì)胞(dendritic cells，DCs) 分為2 個(gè)亞群，髓樣樹突細(xì)胞(myeloid DCs，mDCs) 和漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞(plasmacytoid DC，pDCs)。mDCs特征性表達(dá)CD11C、CD13、CD33、CD11b，主要發(fā)揮抗原提呈功能，促進(jìn)Th1 細(xì)胞極化和細(xì)胞免疫應(yīng)答的發(fā)生；pDCs 特征性表達(dá)CD123、CD303 和CD304，可產(chǎn)生大量Ⅰ型干擾素[18]。Villani 等[19]應(yīng)用scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)了“AS DCs”，即AXL＋SIGLEC6＋DCs，此類DC 細(xì)胞亞群具有和pDC 相近的功能，但卻可以更有效的激活T 細(xì)胞。除此之外，還對(duì) CD1C＋DCs 進(jìn)一步分群。其中 CD32B＋、CD1C＋、CD11C＋為CD1C-A 細(xì)胞，高表達(dá)MHC-Ⅱ類基因，如HLA-DQA1、HLA-DPB1 等；CD32B-、CD1C＋、CD11C＋、CD163＋、CD36＋為CD1C-B 細(xì)胞，高表達(dá)與急、慢性炎癥相關(guān)的基因，如CD14、S100A9、S100A8 等，這兩種DC 細(xì)胞均可以有效誘導(dǎo)原始T 細(xì)胞增殖。

2.1.2 外周T 輔助細(xì)胞及成纖維細(xì)胞:CyTOF 質(zhì)譜流式細(xì)胞儀是已公認(rèn)的確定細(xì)胞亞群的方法之一，2017年，Rao 等[20]通過這一技術(shù)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA) 滑膜組織鑒定出了高表達(dá)MAF、CXCL13 和PDCD1 的新型“外周T 輔助細(xì)胞(peripheral T helper cell，TPH) ” 群，該細(xì)胞群具有促進(jìn)B 細(xì)胞活化，產(chǎn)生抗體的特點(diǎn)。近期，應(yīng)用scRNA-seq 技術(shù)亦鑒定出此類高表達(dá)MAF、CXCL13 和PDCD1 且促進(jìn)B 細(xì)胞分化的細(xì)胞亞群[17]，由此可見scRNA-seq 技術(shù)具有和CyTOF 質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)一樣的可以對(duì)復(fù)雜細(xì)胞群體進(jìn)行精細(xì)分群的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)。

在此基礎(chǔ)上，該研究還通過scRNA-seq 技術(shù)在RA 患者滑膜組織中鑒定出兩種新型成纖維細(xì)胞，分別表達(dá)CD55 和CD90，其中CD55＋成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞增值，調(diào)節(jié)ROS 有關(guān)；CD90＋成纖維細(xì)胞與金屬肽酶活性及胞外基質(zhì)產(chǎn)生有關(guān)。

2.1.3 軟骨細(xì)胞:骨關(guān)節(jié)炎o(hù)steoarthritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)破壞為特點(diǎn)的疾病[21]，軟骨細(xì)胞表達(dá)和分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)維持軟骨正常功能。已知的軟骨細(xì)胞分型中，增殖軟骨細(xì)胞主要存在于軟骨生長(zhǎng)部位的可再生區(qū)域，肥大前軟骨細(xì)胞可調(diào)節(jié)軟骨肥大分化，肥大軟骨細(xì)胞能誘導(dǎo)基質(zhì)礦化，衰老細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞周期循環(huán)阻遏和與衰老相關(guān)的分泌表型[22]，而軟骨祖細(xì)胞具有維持OA軟骨修復(fù)和自身穩(wěn)態(tài)的作用[23]。Ji 等[24]對(duì)OA 患者不同疾病部位分離的軟骨細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq 分析后，根據(jù)其各自的功能特點(diǎn)定義了7 種軟骨細(xì)胞，包括新發(fā)現(xiàn)的3 種新型細(xì)胞亞型:效應(yīng)軟骨細(xì)胞、調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞、自穩(wěn)軟骨細(xì)胞。效應(yīng)軟骨細(xì)胞與細(xì)胞代謝相關(guān)，表現(xiàn)為高水平攝取與三羧酸循環(huán)和氨基酸代謝相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞高表達(dá)與抗原加工、提呈相關(guān)的基因，并檢測(cè)到此類細(xì)胞有MHC 分子相關(guān)基因的表達(dá)，提示調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞在OA 軟骨中可能發(fā)揮免疫細(xì)胞的作用。同時(shí)，在OA 軟骨退化中，生物節(jié)律系統(tǒng)在維持細(xì)胞代謝中起重要作用[25]。其中自穩(wěn)軟骨細(xì)胞高表達(dá)與生物節(jié)律系統(tǒng)相關(guān)的基因，例如PER1 和SIRT1 等，所以此類細(xì)胞可能參與調(diào)節(jié)軟骨變性、退化過程，為軟骨再生研究提供方向。

2.1.4 腸固有層間充質(zhì)細(xì)胞:腸固有層間充質(zhì)細(xì)胞是非造血、非上皮細(xì)胞類型的異質(zhì)群體，在先天免疫、免疫調(diào)節(jié)和上皮屏障維持中起著重要作用[26]。在發(fā)生炎癥性腸病(IBD) 時(shí)，它們通過介導(dǎo)炎癥性環(huán)境，促進(jìn)腸狹窄和炎癥相關(guān)癌癥發(fā)生。對(duì)健康人和初治的IBD 患者結(jié)腸組織的16 500個(gè)間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq 分析后，確定了四種類型的間充質(zhì)細(xì)胞亞群[27]:S1 ～S4。S1 富含非纖維膠原蛋白 (COL14A1，COL15A) 和彈性纖維(FBLN1，F(xiàn)BLN2，F(xiàn)BLN5，EFEMP1，F(xiàn)N1)；S2特異性表達(dá)SOX6 和片狀膠原蛋白 (COL4A5，COL4A6)，而片狀膠原蛋白是上皮基底膜的主要成分，提示S2 細(xì)胞在維持上皮屏障中發(fā)揮作用；S3 與超分子纖維組織相關(guān)；S4 類細(xì)胞具有促炎作用，與調(diào)節(jié)T 細(xì)胞活化，正向調(diào)節(jié)白細(xì)胞遷移相關(guān)。在IBD 中，SOX6＋S2 類細(xì)胞明顯減少，片狀膠原產(chǎn)生減少，進(jìn)而可導(dǎo)致上皮屏障功能紊亂；S4 類細(xì)胞明顯增多，發(fā)揮促炎作用參與IBD 進(jìn)展。

綜上，scRNA-seq 技術(shù)可以高效、迅速發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的新的細(xì)胞亞群，通過后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從而證明相應(yīng)細(xì)胞亞群在疾病中發(fā)揮的作用，進(jìn)而揭示特殊細(xì)胞群體在疾病發(fā)生發(fā)展的作用，提供更廣闊的科研思路。

2.2 scRNA-seq 在確定細(xì)胞異質(zhì)性及疾病標(biāo)志性致病基因中的應(yīng)用

根據(jù)細(xì)胞表面分子表達(dá)差異，NKT 細(xì)胞分為NKT1、NKT2、NKT17 及NKT0 四群，其中NKT0是其他三群的前體細(xì)胞。scRNA-seq 基因異質(zhì)性分析發(fā)現(xiàn)[28]，NKT1 中Ccl5，NKT2 中Irf4，NKT17中Ccr2 存在差異性表達(dá)，為NKT 細(xì)胞功能差異性研究提供方向。

Th17 細(xì)胞高表達(dá)IL-17，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，招募DCs、T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞到炎癥部位，引起炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)組織損傷，參與多種自身免疫性疾病發(fā)病。scRNA-seq 對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE) 小鼠的研究確定了驅(qū)動(dòng)Th17 細(xì)胞致病的四個(gè)關(guān)鍵基因:Gpr65、Plzp、Toso 和Cd5l，并在相應(yīng)基因敲出小鼠中得到了驗(yàn)證，可為多發(fā)性硬化的治療提供潛在的靶點(diǎn)[29]。其中GPR65 基因除與EAE 相關(guān)外，還與強(qiáng)直性脊柱炎[30]，IBD[31-32]等具有密切關(guān)系，并且Toso 基因表達(dá)在疾病發(fā)展中扮演促炎作用。

對(duì)RA 患者滑膜組織成纖維細(xì)胞進(jìn)行scRNAseq 后發(fā)現(xiàn)[33]，和OA 患者相比，在滑膜組織深層，RA 患者CD34-THy1＋的成纖維細(xì)胞在毛細(xì)血管周圍明顯富集，并且成纖維細(xì)胞Thy1 基因表達(dá)明顯升高[34]，而THy1 基因的表達(dá)可以使成纖維細(xì)胞具有分化成脂肪細(xì)胞的傾向[35]，并且該基因同時(shí)參與神經(jīng)元發(fā)育和腫瘤發(fā)生。

而在OA 中，確定了軟骨祖細(xì)胞的標(biāo)志性基因[24]:BIRC5、CENPU、UNE2C、DHFR 和STMN1，這些基因與軟骨祖細(xì)胞細(xì)胞循環(huán)、染色體重建、DNA 復(fù)制等功能密切相關(guān)。

與健康人皮膚角化細(xì)胞相比，scRNA-seq 分析檢測(cè)到狼瘡腎炎患者來(lái)源的角化細(xì)胞其IFN 誘導(dǎo)基因IFI27、STAT1、IFI6、IFITM1 明顯高表達(dá)，進(jìn)一步支持IFN 反應(yīng)通路參與SLE 發(fā)病[36]。

故通過scRNA-seq 方法可迅速、高效的確定靶向基因，明確鎖定工作目標(biāo)，在尋找標(biāo)志性致病基因，確定細(xì)胞異質(zhì)性中具有指導(dǎo)性意義。

2.3 scRNA-seq 在確定免疫細(xì)胞動(dòng)態(tài)演變過程中的應(yīng)用

scRNA-seq 還可以用于檢測(cè)細(xì)胞動(dòng)態(tài)過程，包括細(xì)胞分化、成熟[37-39]，對(duì)刺激后的反應(yīng)和活化[40]、以及循環(huán)過程:包括新陳代謝規(guī)律和細(xì)胞循環(huán)[41]。對(duì)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)演變過程進(jìn)行建模分析其基因表達(dá)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，并分析在疾病過程中可能出現(xiàn)的調(diào)節(jié)紊亂。免疫細(xì)胞發(fā)育成熟過程發(fā)生紊亂可以導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，例如X 連鎖無(wú)丙種球蛋白血癥，即是由于Btk 基因缺陷導(dǎo)致酪氨酸激酶合成障礙，使B 細(xì)胞發(fā)育停滯在前B 細(xì)胞狀態(tài)，導(dǎo)致成熟B 細(xì)胞數(shù)目減少，甚至缺失。所以通過動(dòng)態(tài)分析可以確定調(diào)節(jié)特定階段的調(diào)節(jié)因素，并確定這些因素對(duì)于調(diào)節(jié)下一階段的基因表達(dá)的必要程度。

在單細(xì)胞水平研究免疫細(xì)胞發(fā)育、成熟軌跡，可以確定細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)生紊亂的關(guān)鍵點(diǎn)，并判斷這種紊亂是如何影響下游信號(hào)通路的。Shalek 等[40]對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的DC 應(yīng)答反應(yīng)的系列研究發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞應(yīng)答的旁分泌機(jī)制:DC 中的小部分細(xì)胞即早熟DC 在病原體刺激早期出現(xiàn)抗病毒基因的轉(zhuǎn)錄激活并分泌干擾素，早熟DC通過干擾素介導(dǎo)的旁分泌信號(hào)激活抗病毒基因在其余DC 中的表達(dá)。在單細(xì)胞水平上揭示了免疫細(xì)胞在接受刺激后作出反應(yīng)的級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)機(jī)制。另外，小鼠感染模型中進(jìn)行CD4＋T 細(xì)胞的離體scRNA-seq 證實(shí)了Th2 細(xì)胞的三種狀態(tài)，即活化狀態(tài)，中間活化狀態(tài)以及產(chǎn)生細(xì)胞因子狀態(tài)。對(duì)該過程的理解可以用于T 細(xì)胞免疫療法，成為免疫調(diào)節(jié)的新靶標(biāo)，為自身免疫性疾病治療提供思路[42]。Ji 等[24]將OA 患者軟骨細(xì)胞進(jìn)行scRNAseq 擬時(shí)間軌跡分析后，確定了在病情發(fā)展過程中增殖軟骨細(xì)胞、肥大前軟骨細(xì)胞、肥大軟骨細(xì)胞的線性轉(zhuǎn)化過程，及在各個(gè)階段相關(guān)標(biāo)志性基因表達(dá)的差異，為骨關(guān)節(jié)炎的分期、治療提供有力依據(jù)。

3 總結(jié)與展望

目前scRNA-seq 技術(shù)仍在迅速發(fā)展，并在免疫學(xué)研究中得以廣泛應(yīng)用，為自身免疫機(jī)制及自身免疫病發(fā)病過程中參與的相關(guān)細(xì)胞的異質(zhì)性的探索提供高效檢測(cè)方法，可用于確定疾病中特定細(xì)胞的分子易感性并為干預(yù)治療提供候選靶標(biāo)分子，實(shí)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上確定相關(guān)細(xì)胞轉(zhuǎn)化方式。scRNA-seq 與生物信息學(xué)技術(shù)的緊密結(jié)合，為揭示細(xì)胞發(fā)育和分化過程中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了強(qiáng)有力的檢測(cè)方法。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，scRNA-seq 終將造福于自身免疫病發(fā)病機(jī)制及免疫治療的研究。