表沒食子兒茶素沒食子酸酯對脊髓損傷后小鼠神經(jīng)功能的恢復作用及機制研究

吳凱 封志云 胡小堅

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴重的損傷，常導致?lián)p傷平面以下感覺、運動功能障礙，致殘率高，給個人、家庭及社會帶來了巨大的負擔。目前，對于SCI仍無有效的治療方法。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶中提取的多酚的活性成分，能清除氧自由基，易透過血腦屏障，是重要的天然抗氧化劑。研究表明，EGCG具有抗腫瘤、抗細胞凋亡、抗炎等多種生物學效應[1-3]。同時，大量研究證實EGCG對于神經(jīng)細胞具有保護作用[4-5]，但其機制仍不明確。本研究采用擠壓型方法制作小鼠急性SCI動物模型，術(shù)后通過小鼠BMS評分評價EGCG對SCI后小鼠神經(jīng)功能的恢復作用，并觀察脊髓組織細胞形態(tài)變化，檢測Cleaved Caspase-3、B細胞淋巴瘤因子2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）蛋白表達水平，以探討其潛在機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取雌性健康SPF級C57BL/6小鼠35只，體重18～24g，購于上海實驗動物中心，于浙江大學實驗動物中心分籠飼養(yǎng)，每籠5只。動物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境內(nèi)，室溫控制在20～25℃，給予動物12h光照/12h黑暗交替的環(huán)境。所有動物自由攝食攝水。操作均嚴格遵守《實驗動物管理條例》的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要器材和試劑 血管夾（15g）購自上海醫(yī)療器械有限公司，EGCG（E4143，50mg）購自美國 Sigma-Aldrich公司，Cleaved Caspase-3抗體（9661）和 Bax抗體（14796）購自美國Cell Signalling Technology公司、Bcl-2抗體（ab182858）購自美國Abcam公司。

1.3 小鼠急性SCI動物模型建立及分組 采用擠壓型方法制作小鼠急性SCI動物模型，具體操作如下：用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉小鼠，俯臥位固定，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾。在T8～10水平作背部正中切口，充分暴露并切除T8～10棘突及椎板，充分暴露脊髓T9節(jié)段，用15g力度的血管夾夾住T9段脊髓1min，夾閉1min后放開血管夾。止血后逐層縫合切口。制作SCI小鼠25只，為保證模型統(tǒng)一標準，造模后進行行為學檢測，選取行為學評分≤1分的小鼠20只（剔除行為學評分＞1分的小鼠5只）。采用隨機數(shù)字表法將造模成功的20只小鼠分為EGCG組和SCI組，每組10只。另10只未造模的小鼠僅行椎板切除，作為假手術(shù)組。EGCG組小鼠于造模后給予EGCG（50mg/kg，50mg溶于10ml 0.9%氯化鈉注射液，10ml/kg）腹腔注射，1次/d，連續(xù) 7d。假手術(shù)組和SCI組小鼠給予0.9%氯化鈉注射液（10ml/kg）腹腔注射，1 次/d，連續(xù) 7d。

1.4 行為學評分 根據(jù)文獻報道[6]，將小鼠后肢運動功能分為10個等級，完全正常行走為9分，后肢完全癱瘓為0分。分別于術(shù)后第1、3、5、7天進行小鼠BMS評分，將動物置于寬闊活動場地自由活動5min，觀察其后肢運動情況，左右兩側(cè)肢體分別評分，取平均值為每只大鼠的功能得分。由不參與動物分組與治療但熟悉評分標準的2位觀察者同時獨立進行評分，取平均值。

1.5 脊髓組織細胞形態(tài)變化觀察 術(shù)后第7天，每組取6只小鼠進行病理學觀察，腹腔注射過量戊巴比妥鈉深度麻醉小鼠，經(jīng)左心室灌注0.9%氯化鈉注射液至流出澄清液，再用4%多聚甲醛心臟灌注固定后，以損傷中心區(qū)為中點取1cm左右脊髓組織樣本，PBS清洗后置于4%多聚甲醛中固定，再行脫水、包埋、切片等步驟，行HE染色，鏡下觀察各組脊髓瘢痕和空洞面積，評價脊髓損傷程度。

1.6 脊髓組織Cleaved Caspase-3表達水平檢測 采用免疫組化法。上述小鼠每只取5張距損傷中心或相應部位0.5cm內(nèi)的切片，常規(guī)脫蠟，3%過氧化氫處理、高溫修復、血清封閉、一抗 4℃過夜（濃度為 1∶150），同時用PBS代替一抗作為陰性對照，隔日滴加二抗，室溫孵育30min，繼而二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，甘油封片后，倒置顯微鏡下觀察切片陽性表達（棕色）的部位及強弱程度，用Image-Pro Plus 6.0軟性行平均光密度分析。以上各步驟間均用PBS充分漂洗3次，5min/次。

1.7 脊髓組織Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。術(shù)后第7天，每組取4只小鼠腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死，直視下取出包含損傷部位在內(nèi)的1cm脊髓組織，獲取脊髓蛋白，根據(jù)蛋白濃度進行等量上樣，電泳，轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉封閉，4℃一抗 Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2 孵育過夜，洗膜，室溫下熒光二抗孵育1h，充分洗膜，ECL試劑發(fā)光，暗室曝光顯影。凝膠成像分析系統(tǒng)上攝像分析，并定量分析條帶灰度。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠BMS評分比較 SCI后，小鼠雙后肢均全癱。與假手術(shù)組比較，術(shù)后各時點SCI組和EGCG組小鼠BMS評分均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與 SCI組比較，術(shù)后第 3、5、7 天 EGCG 組小鼠BMS評分均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 3組小鼠BMS評分比較（分）

2.2 小鼠脊髓組織病理檢查結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示假手術(shù)組小鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)細胞分布均勻；SCI組小鼠脊髓組織中神經(jīng)細胞核仁模糊，細胞腫脹，周圍間隙增大，出現(xiàn)大量壞死細胞，形成大量空泡，炎性細胞浸潤程度高；EGCG組小鼠壞死神經(jīng)細胞較SCI組有所減少，空泡數(shù)量減少，炎性細胞浸潤程度低，見圖1。

圖1 小鼠脊髓組織病理切片所見（a：假手術(shù)組；b：SCI組；C：EGCG組；HE染色，×20）

2.3 3組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3表達水平比較 術(shù)后第7天，與假手術(shù)組比較，SCI組和EGCG組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3的表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與SCI組比較，EGCG組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3的表達有所降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2-3。

圖2 3組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3免疫組化染色結(jié)果（a：假手術(shù)組小鼠Cleaved Caspase-3無明顯陽性表達；b：SCI組小鼠可見大部分細胞表達強陽性；C：EGCG組小鼠可見部分細胞表達陽性；免疫組化染色，×40）

圖3 3組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3表達的平均光密度值比較（與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與 SCI組比較，△P＜0.05）

2.4 3組小鼠脊髓組織凋亡相關(guān)蛋白表達水平比較 術(shù)后第7天，與假手術(shù)組比較，SCI組和EGCG組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3及Bax蛋白表達水平均升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與SCI組比較，EGCG組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3及Bax蛋白表達水平均降低，Bcl-2蛋白表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 3組小鼠脊髓組織凋亡相關(guān)蛋白表達水平比較（a：3組小鼠脊髓組織凋亡相關(guān)蛋白表達的電泳圖；b：3組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3蛋白表達水平比較；c：3組小鼠脊髓組織Bax蛋白表達水平比較；d：3組小鼠脊髓組織Bcl-2蛋白表達水平比較；與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與 SCI組比較，△P＜0.05）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EGCG治療后，SCI小鼠的BMS評分明顯升高，提示EGCG可明顯改善SCI小鼠神經(jīng)功能的恢復。SCI可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷發(fā)生在損傷當時，其結(jié)果是不可逆的，而繼發(fā)性損傷則是損傷后發(fā)生的一系列復雜的分子生物學反應引起的神經(jīng)元可逆性損傷，因此，有效抑制繼發(fā)性損傷是治療SCI的重點。脊髓繼發(fā)性損傷的過程十分復雜，其機制包括缺血缺氧[7]、脂質(zhì)過氧化[8]、細胞內(nèi)鈣離子超載[9]、興奮性氨基酸毒性[10]、神經(jīng)細胞凋亡[11]等。其中，神經(jīng)細胞凋亡是繼發(fā)性損傷的重要病理基礎(chǔ)，因此，抑制神經(jīng)細胞凋亡可有效減少繼發(fā)性損傷，促進神經(jīng)功能恢復。

細胞凋亡是受一系列連續(xù)基因調(diào)控的程序化反應，通?？梢苑譃樗劳鍪荏w（外源性）和線粒體（內(nèi)源性）兩條途徑。在凋亡過程中，Bcl-2家族蛋白起重要調(diào)控作用，主要參與細胞的內(nèi)源性凋亡途徑完成對細胞凋亡的調(diào)控。Bcl-2家族可以分為兩類：一類是抗凋亡基因，代表基因是Bcl-2基因；另一類是促凋亡基因，代表基因是Bax基因。而Caspase-3是細胞凋亡蛋白級聯(lián)反應的必經(jīng)之路，當細胞發(fā)生凋亡時，Caspase-3被活化成Cleaved Caspase-3，它的活化是凋亡進入不可逆階段的標志[12-14]。EGCG是從綠茶中提取的多酚的活性成分，研究表明，EGCG具有很強的抗氧化活性，可抑制各種誘因?qū)е碌募毎蛲觯瑢毎哂斜Ｗo作用。Shi等[15]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可以通過激活NRF2/HO-1通路來抑制微囊藻毒素誘導的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的凋亡；Yan等[16]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可以通過抑制氧化應激來抑制H2O2誘導的血管平滑肌細胞的凋亡；Du等[17]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡來減少阿爾茲海默病中的神經(jīng)毒性。本實驗觀察到，SCI小鼠Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平均升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，EGCG治療后，小鼠Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平均降低，Bcl-2蛋白表達水平升高，提示EGCG對SCI小鼠有明顯的抗凋亡作用。

綜上所述，EGCG治療可明顯促進SCI小鼠神經(jīng)功能的恢復，其對小鼠發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制可能與抑制神經(jīng)細胞凋亡密切相關(guān)。本研究結(jié)果證實了EGCG治療對SCI小鼠的保護作用，這為SCI的基礎(chǔ)和臨床治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。然而，這一作用具體的分子機制還需進一步的研究去揭示。