不同氮磷比對小球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)及生長的影響

薄香蘭 劉興 竇勇

摘要：以小球藻（Chlorella vulagris）為研究對象，研究不同氮磷比對其葉綠素?zé)晒?、葉綠素含量和細(xì)胞密度的影響，以期找到小球藻生長最適的氮磷比，為小球藻的規(guī)?；囵B(yǎng)提供基礎(chǔ)資料。結(jié)果表明：不同濃度的氮磷比對小球藻的葉綠素?zé)晒狻⑷~綠素含量和細(xì)胞密度有顯著影響，各處理組均呈上升趨勢，其中17.30 ∶ 1處理組的最大光能轉(zhuǎn)化速率Fv/Fm、潛在活力Fv/Fo、實際光能轉(zhuǎn)化效率ΦPS Ⅱ和量子效率Yield、相對電子轉(zhuǎn)化速率ETR均高于其他處理組，34.60 ∶ 1 處理組葉綠素含量和細(xì)胞密度最高，其值分別為3 231.81 μg/L和1.07×107個/mL。138.40 ∶ 1處理組上升趨勢最小，且各處理組的熒光參數(shù)指標(biāo)在試驗后8 d開始呈下降趨勢。小球藻在氮磷比為17.30 ∶ 1生長最好。

關(guān)鍵詞：小球藻;葉綠素?zé)晒鈪?shù);葉綠素含量;細(xì)胞密度;氮磷比

中圖分類號： S184 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0169-04

氮和磷是藻類生長中最常見的限制因子[1]，氮是蛋白質(zhì)和葉綠素等物質(zhì)的組成成分，限氮會影響植物葉綠素的合成，進(jìn)而影響到其光合作用[2]。磷作為藻類生長發(fā)育的必需元素直接參與光合作用的各個過程，限磷會影響光合磷酸化水平，使代謝合成受阻，光合速率下降[3]。因此，水體中的氮磷比（N/P）直接影響藻類細(xì)胞的生長及物質(zhì)的積累[4]。目前關(guān)于氮磷比對藻類的研究大都集中在對藻類生物量和群落結(jié)構(gòu)變化的影響上[5-6]，對葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)和葉綠素含量的研究比較少。

葉綠素?zé)晒猬F(xiàn)象是在1834年由傳教士Brewster最先發(fā)現(xiàn)的[7]，1932年由Kautsky和Hirsch發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象和光合特性之間的關(guān)系[8]，1986年Schreiber發(fā)明了可以檢測熒光誘導(dǎo)動力學(xué)的PAM儀器（pulse-amplitude-modulation）[9]。作為光合作用的良好探針，葉綠素?zé)晒鈪?shù)是鑒定藻類耐逆境能力的良好指標(biāo)之一，具有快速、準(zhǔn)確、簡單的特點(diǎn)[10-11]。小球藻在分類上屬于綠藻門，個體微小，營養(yǎng)豐富，易于繁殖，在動物飼料、食品添加劑、美容產(chǎn)品、食品開發(fā)、醫(yī)藥保健等領(lǐng)域都有巨大的應(yīng)用潛力。本試驗利用葉綠素?zé)晒鈨x（PHYTO-PAM WALZ），在保持磷不變的基礎(chǔ)上，設(shè)置5個氮磷比梯度，通過檢測葉綠素?zé)晒鈪?shù)和藻密度，以期找到適合小球藻生長的氮磷比，為小球藻的大規(guī)模培養(yǎng)提供參考依據(jù)，同時，為葉綠素?zé)晒猬F(xiàn)象在確定藻類適宜氮磷比值上的可行性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與時間地點(diǎn)

試驗用小球藻（Chlorela vulagris）來源于天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實驗室。

試驗時間為2017年5月10—20日。試驗地點(diǎn)為天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實驗室。

1.2 培養(yǎng)條件

將初始密度為1×106個/mL的小球藻藻液以1 ∶ 1的比例接種于藍(lán)綠培養(yǎng)基（BG-11 medium for blue green algae，BG-11培養(yǎng)基）中，以硝酸鈉（NaNO3）為氮源，設(shè)置5個氮磷比梯度，分別為8.65 ∶ 1（NaNO3濃度為2.5 mol/L）、17.30 ∶ 1（NaNO3濃度為5 mol/L）、34.60 ∶ 1（NaNO3濃度為10 ml/L）、69.20 ∶ 1（NaNO3濃度為20 mol/L）、138.40 ∶ 1（NaNO3濃度為40 mol/L），光照條件為60 μmol/（m2·s），溫度為25 ℃，光—暗比為12 h—12 h，每組設(shè)定3個平行，于恒溫光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每天定時搖動4次，以防小球藻細(xì)胞附壁及下沉。

1.3 試驗儀器

葉綠素?zé)晒鈨x（PHYTO-PAM WALZ）、超凈工作臺（SW-CJ-1FD上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備工廠）、高壓蒸汽滅菌鍋（HVE-50 HIRAYMA儀器制造公司）、生物顯微鏡（E200日本Nikon）、藻類培養(yǎng)箱（AL-36美國珀爾瓦西）、電子天平（AS2202X2 RADWAG）。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 微量元素溶液（A5） 將2.86 g的硼酸（H3BO3）、1.86 g 的四水氯化錳（MnCl2·4H2O）、0.22 g的七水硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）、0.39 g的鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）、0.08 g的五水硫酸銅（CuSO4·5H2O）、0.05 g的六水硝酸鈷 [CO（NO3）2·6H2O]依次溶于1 L的蒸餾水中。

1.4.2 BG-11培養(yǎng)基 將1.5 g的硝酸鈉（NaNO3）、0.052 g 的磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）、0.075 g的硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、0.036 g的氯化鈣（CaCl2·2H2O）、0.006 g的檸檬酸、0.006 g的檸檬酸鐵胺、0.001 g的EDTA（Na2）、0.2 g 的碳酸鈉（Na2CO3）、1 mL的A5溶液依次溶于1 L的蒸餾水中。

1.5 測定方法

將處于對數(shù)期的小球藻接種到配好的培養(yǎng)基中，并記錄為試驗的0 d，在試驗后0、2、4、6、8、10 d定時取樣，測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)、葉綠素含量和藻密度。

1.5.1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定 利用浮游植物分類熒光儀（PHYTO-PAM WALZ）對葉綠素?zé)晒飧鱾€參數(shù)進(jìn)行測定，打開Phyto Win軟件，先放置1 cm樣品（每次體積應(yīng)統(tǒng)一）在比色皿中暗適應(yīng)15 min，啟動儀器測定初始熒光產(chǎn)量（Fo），飽和脈沖后測定最大熒光產(chǎn)量（Fm），以此計算出最大光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm），打開預(yù)先設(shè)定好的光化學(xué)強(qiáng)度，進(jìn)行1 min的照射（儀器指示燈變綠為光化學(xué)結(jié)束），待熒光值穩(wěn)定后，測定出光化學(xué)后初始熒光（Fs）和最大熒光（Fm′）。Settings窗口中將Meas. Freq.設(shè)置為32，切換到Channeles窗口，點(diǎn)擊CHL，測出葉綠素的含量。測定的葉綠素?zé)晒鈪?shù)有Fo、Fm、Fo′、Fm′、Fs，并根據(jù)熒光儀提供的公式計算出Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、ETR、ΦPSⅡ等熒光參數(shù)。

1.5.2 藻密度測定 小球藻密度測定通過血球計數(shù)板計數(shù)獲得。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，利用Excel 2007進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮磷比對小球藻葉綠素?zé)晒饣钚缘挠绊?/p>

2.1.1 不同氮磷比對小球藻Fv/Fm的影響 Fv/Fm反映了光反應(yīng)中心PS Ⅱ的最大量子產(chǎn)量，即最大光能轉(zhuǎn)化效率，在受到環(huán)境條件脅迫時，其值會降低，此指標(biāo)常用來判斷植物是否受到條件抑制[12]。由圖1可知，在整個培養(yǎng)期間，各處理組的Fv/Fm均呈上升趨勢，以17.30 ∶ 1處理組最高，34.60 ∶ 1 次之，138.42 ∶ 1最低，至培養(yǎng)結(jié)束時，34.60 ∶ 1、8.65 ∶ 1、69.20 ∶ 1、138.40 ∶ 1處理組的最高值各維持在17.30 ∶ 1處理組最高值的97.73%、91.84%、86.81%、80.58%，說明本試驗設(shè)置的5組氮磷比對小球藻Fv/Fm值沒有抑制作用，同時，各組的Fv/Fm均在8 d后呈下降趨勢，說明此時各組的氮磷比都不能滿足藻類的生長需求，推測原因是營養(yǎng)鹽消耗殆盡的結(jié)果。17.30 ∶ 1處理組的Fv/Fm從試驗后 2 d 開始就高于其他各組，說明小球藻對該濃度的氮磷比適應(yīng)良好。

2.1.2 不同氮磷比對小球藻Fv/Fo的影響 Fv/Fo反映了光反應(yīng)中心PS Ⅱ的潛在活性，其值受到脅迫時下降，是用來判斷光合作用是否受到抑制的指標(biāo)之一[13]。由圖2可知，各處理組的Fv/Fo在試驗后0～8 d呈上升趨勢，在試驗后8 d后開始下降，培養(yǎng)結(jié)束時，以17.30 ∶ 1處理組最高，34.60 ∶ 1次之，138.40 ∶ 1最低。各組Fv/Fo值在試驗后2 d開始上升，說明此時的氮磷比都能滿足光反應(yīng)中心PS Ⅱ吸收量子的能力，在試驗后 8 d 各組都呈下降趨勢，表明此時小球藻的光合作用開始受到抑制。

2.1.3 不同氮磷比對小球藻ΦPS Ⅱ的影響 ΦPS Ⅱ是指光反應(yīng)中心PS Ⅱ的實際光能轉(zhuǎn)化效率[14]。由圖3可知，所有處理組的ΦPS Ⅱ的在試驗后0 d均維持在0.28±0.01，且隨著時間增加呈上升趨勢，以17.30 ∶ 1組的ΦPS Ⅱ值最高，之后依次為 34.60 ∶ 1>8.65 ∶ 1>69.20 ∶ 1>138.40 ∶ 1。到試驗后 10 d，138.40 ∶ 1處理組的ΦPS Ⅱ維持在17.30 ∶ 1處理組的75.11%。

2.1.4 不同氮磷比對小球藻Yield的影響 Yield指在光合作用中每吸收一個光量子，所固定CO2分子數(shù)或者釋放O2的分子數(shù)[15]。由圖5可知，各處理組的Yield均在第8 d時達(dá)到峰值，至培養(yǎng)結(jié)束時，17.30 ∶ 1處理組較峰值下降93.30%，34.60 ∶ 1 處理組較峰值下降92.42%，8.65 ∶ 1、69.20 ∶ 1 和138.40 ∶ 1處理組較峰值下降差別不大，分別為88.46%、88.51%、88.56%。PSⅡ量子下降的速率，說明光反應(yīng)中心受抑制的程度越嚴(yán)重，代謝合成受到阻礙程度越高。

2.1.5 不同氮磷比對小球藻ETR的影響 ETR表示光反應(yīng)中心PS Ⅱ光合電子的傳遞速率，圖5顯示， 在小球藻的一次性培養(yǎng)過程中，各處理組的ETR值呈上升趨勢，依次為 17.30 ∶ 1>34.60 ∶ 1>8.65 ∶ 1>69.20 ∶ 1>138.40 ∶ 1，在試驗后8 d出現(xiàn)下降趨勢。

2.2 不同氮磷比對小球藻葉綠素含量的影響

藻體內(nèi)的葉綠素含量與其光合作用、生長密切相關(guān)。圖6表明，隨著培養(yǎng)時間的增加，各處理組葉綠素含量不斷增加，培養(yǎng)結(jié)束時，以34.60 ∶ 1處理組葉綠素含量最高，其值為3 231.81 μg/L，17.30 ∶ 1處理組次之，其值為 2 964.44 μg/L，接下來依次為69.20 ∶ 1>138.40 ∶ 1>8.65 ∶ 1。

2.3 不同氮磷比小球藻細(xì)胞密度影響

不同氮磷比對小球藻細(xì)胞密度影響見圖7，隨著培養(yǎng)時間的增加，各處理組的細(xì)胞密度均呈上升趨勢，其中以 17.30 ∶ 1 μmol/L 處理組細(xì)胞密度增加最快，在試驗后10 d，細(xì)胞密度達(dá)到1.07×107個/mL，為接種時的2.50倍。34.60 ∶ 1 處理組次之，培養(yǎng)結(jié)束時細(xì)胞密度為接種時的2.31倍。138.40 ∶ 1處理組增長最慢，培養(yǎng)結(jié)束時細(xì)胞密度為初始接種量的2.01倍。至培養(yǎng)結(jié)束時，各組細(xì)胞密度依次表現(xiàn)為34.60 ∶ 1>17.30 ∶ 1>8.65 ∶ 1>69.20 ∶ 1>138.40 ∶ 1。

3 討論與結(jié)論

葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)以藻類葉綠體的細(xì)胞器官為材料，反映光合作用過程中的光能吸收、激發(fā)能傳遞、光化學(xué)反應(yīng)、電子傳遞、質(zhì)子梯度的建立、ATP合成和CO2固定等光合作用的動態(tài)變化及各種外界因素對藻類的微妙影響[16-17]，其原理是藻類細(xì)胞內(nèi)的葉綠素分子通過直接或間接吸收光量子獲得能量后，從基態(tài)（低態(tài)能）飛躍到激發(fā)態(tài)（高態(tài)能）[18]，熒光是在電子從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)的過程中產(chǎn)生的[19]。熒光各參數(shù)指標(biāo)與逆境受脅迫程度存在密切的相關(guān)性，當(dāng)藻類在逆境條件發(fā)生光抑制時，葉綠素各熒光參數(shù)均呈下降趨勢[20]。本試驗結(jié)果表明，小球藻氮磷比為17.30 ∶ 1時各熒光參數(shù)指標(biāo)值最高，在氮磷比為34.60 ∶ 1時葉綠素含量和細(xì)胞密度最高。從試驗后0～8 d各組葉綠素?zé)晒鈪?shù)指標(biāo)均呈上升趨勢，說明本試驗設(shè)置的5組氮磷比梯度并未對小球藻的光合系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的抑制作用，光能轉(zhuǎn)化效率始終保持在較活躍的狀態(tài)。從試驗后8 d Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR、Yield開始出現(xiàn)下降趨勢，說明光反應(yīng)中心PSⅡ受到損害，電子傳遞速率下降，導(dǎo)致光合作用各反應(yīng)過程受到抑制，其主要是由于隨著培養(yǎng)時間的增加，氮磷等營養(yǎng)鹽消耗殆盡，不能滿足藻類光合作用中吸收量子所需要的能量消耗[21]，進(jìn)而表明本試驗的小球藻生長周期為8 d。雷玉新等研究了不同氮磷質(zhì)量濃度比的培養(yǎng)液對藍(lán)藻生長和葉綠素的影響，發(fā)現(xiàn)水體中氮磷比為40 ∶ 1時，藍(lán)藻的生長速率和葉綠素含量達(dá)到最大值[22]。李慧等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)妆葹?0 ∶ 1時，銅藻幼苗的特定生長率最大[23]。陳慶榮等研究發(fā)現(xiàn)，在氮磷源充足的情況下，青島大扁藻生長最佳的氮磷比是7.17 ∶ 1;當(dāng)?shù)谞I養(yǎng)鹽受到限制的情況下，青島大扁藻生長最佳的氮磷比例是13.71 ∶ 1[24]。劉東艷等研究表明，氮磷比在16 ∶ 1的條件下，球等鞭金藻的生長速度最快，單位水體內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞內(nèi)碳水化合物和蛋白質(zhì)的含量也最高[25]。李冰研究發(fā)現(xiàn)，小球藻最適應(yīng)的氮磷濃度比為16 ∶ 1[26]，與本試驗研究結(jié)果相近。由于不同藻類對氮磷吸收利用率的差異，氮磷比對藻類生長的影響并不表現(xiàn)在一個固定數(shù)值上。

傳統(tǒng)測定藻類最適氮磷比的方法就是在不同氮磷比的培養(yǎng)條件下測定藻類的細(xì)胞密度，這種方法比較耗時，而且準(zhǔn)確度低。本試驗通過測定葉綠素各熒光參數(shù)和葉綠素含量并結(jié)合細(xì)胞密度發(fā)現(xiàn)，各熒光指標(biāo)、葉綠素含量與細(xì)胞密度有密切的相關(guān)性。按增長的速率來看，各組數(shù)值依次為17.30 ∶ 1>34.60 ∶ 1>8.65 ∶ 1>69.20 ∶ 1>138.40 ∶ 1，在整個培養(yǎng)周期，各熒光指標(biāo)和細(xì)胞密度有著顯著的正相關(guān)關(guān)系。因此，利用葉綠素?zé)晒飧黜梾?shù)的變化可以反映小球藻在不同培養(yǎng)條件下的生長情況。陳書秀等研究表明，雨生紅球藻進(jìn)行光合作用和生長最適氮濃度為1 760 μmol/L;最適磷濃度為 18.16 μmol/L，葉綠素相對含量均與細(xì)胞密度呈顯著的正相關(guān)關(guān)系[27]，與本試驗結(jié)果一致。目前，有許多學(xué)者利用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)來對藻類進(jìn)行抗逆性研究，如王昭玉利用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)對氮、磷限制的響應(yīng)，來判斷山東青島近海的氮、磷限制情況[28]。孫開明采用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)測定不同營養(yǎng)鹽條件下的東海原甲藻的葉綠素參數(shù)與生長參數(shù)，研究外部營養(yǎng)鹽濃度及吸收速率的關(guān)系[29]。許珍等利用此技術(shù)研究溫度、光照度對漢斯冠盤藻、小環(huán)藻、斜生柵藻和銅綠微囊藻生長的影響[30]。隨著葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)的進(jìn)一步完善和機(jī)理的明確，此技術(shù)在藻類的其他方面也會發(fā)揮重要的作用。

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