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    硬葉兜蘭菌根結(jié)構(gòu)及菌根真菌空間分布特征

    2019-08-13 08:54:10田凡廖小鋒顏鳳霞
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年2期
    關(guān)鍵詞:分布特征

    田凡 廖小鋒 顏鳳霞

    摘要:為了解瀕危植物硬葉兜蘭菌根真菌在結(jié)構(gòu)及分布方面的特征,采用切片法觀察其菌根結(jié)構(gòu),分離培養(yǎng)不同根齡菌根真菌、根不同部位的菌根真菌,并進(jìn)行觀察、鑒定。結(jié)果表明,硬葉兜蘭菌絲團大多數(shù)分布于根部皮層細(xì)胞,菌絲團數(shù)量由外皮層向皮層細(xì)胞逐漸增加,皮層細(xì)胞向內(nèi)皮層逐漸減少,內(nèi)皮層和中柱細(xì)胞內(nèi)沒有菌絲和菌絲團;皮層中間部位菌根真菌菌絲團數(shù)量最多,高于靠近表皮和靠近中柱部位的菌絲團數(shù)量;根基部、中部和根尖部位都有菌根真菌,但根中部的菌根真菌數(shù)量最多;菌根真菌的種類和數(shù)量隨著根齡的變化而變化,隨著根齡的增加,菌根真菌種類和數(shù)量也相應(yīng)地增加。

    關(guān)鍵詞:硬葉兜蘭;菌根真菌;菌根結(jié)構(gòu);分布;特征

    中圖分類號: Q934 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A ?文章編號:1002-1302(2019)02-0105-04

    蘭科(Orchidaceae Juss.)植物大多數(shù)依賴菌根真菌所提供的營養(yǎng)物質(zhì)來促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長[1]。部分具有綠色葉子和無葉綠素的蘭科植物,整個生長周期都須要與菌根真菌共生[2]。自20世紀(jì)初由Bernard和Burgeff揭示蘭科植物菌根之謎后,國內(nèi)外相繼開展了大量的蘭科植物菌根真菌的研究。近年來也有一些學(xué)者對兜蘭屬(Paphiopedilum Pfitz.)植物菌根真菌進(jìn)行了報道,李明等對杏黃兜蘭(Paphiopedilum armeniacum S. C. Chen & F. Y. Liu)菌根真菌進(jìn)行了研究[3];Yuan等利用分子系統(tǒng)學(xué)方法,對比了野外與移栽到溫室2種不同生境的硬葉兜蘭(Paphiopedilum micranthum Tang & F. T. Wang)和杏黃兜蘭的菌根真菌多樣性[4];Nontachaiyapoom等收集了不同生境的兜蘭屬植物進(jìn)行菌株分離,通過形態(tài)和分子鑒定出了Epulorhiza repens和Epulorhiza calendulina(均暫無中文名)類真菌[5]。

    原產(chǎn)于我國兜蘭屬的硬葉兜蘭,花奇色美,具有非常高的觀賞價值[6]。由于采集過度、走私出境猖獗以及生境破壞等原因,近十幾年來野生硬葉兜蘭的數(shù)量急劇減少,分布區(qū)逐漸萎縮,已經(jīng)到了滅絕的邊緣。硬葉兜蘭野生資源的保護(hù)和人工繁育問題亟待引起社會各界的重視。由于硬葉兜蘭的種子無胚乳,發(fā)芽率極低,雖然目前人工無菌播種已經(jīng)獲得成功,但是出瓶率低、移栽難的問題還沒得到解決。將菌根真菌應(yīng)用于種子萌發(fā)及幼苗的生長,可解決硬葉兜蘭人工有性繁殖難題。本研究對硬葉兜蘭菌根進(jìn)行切片觀察并對其菌根真菌進(jìn)行分離培養(yǎng),分析硬葉兜蘭菌根結(jié)構(gòu)及菌根真菌空間分布特點,以期為蘭科植物內(nèi)生菌根真菌的特征增添素材,為硬葉兜蘭的人工繁殖及其保育工作提供理論基礎(chǔ)和實踐經(jīng)驗。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    試驗材料為硬葉兜蘭成年植株根部,其植株采集于貴州省銅仁地區(qū)德江縣青龍鎮(zhèn)潮水河一帶。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 徒手切片法 將硬葉兜蘭根在流水下沖洗干凈,選取具有菌絲團的根段,徒手切片,用乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液染色,在OLYTMPUS DP70光學(xué)顯微鏡下觀察菌根結(jié)構(gòu)特點并拍照。

    1.2.2 菌株的分離培養(yǎng) 菌株分離培養(yǎng)參考Zhu等的單菌絲團分離法[7-8],具體如下:

    (1)根處理和含菌絲團根段的選擇。截取硬葉兜蘭新鮮根段分裝于盛有無菌水的培養(yǎng)皿中,無菌狀態(tài)下用解剖刀輕輕刮掉根被,顯微鏡檢,選出具有菌絲團的根段,用0.1%氯化汞溶液消毒2~3 min,無菌水沖洗 4~5次,然后用解剖針和鑷子刮菌絲團根段,使單菌絲團從皮層細(xì)胞中游離出來,24 ℃ 恒溫箱培養(yǎng)12 h后顯微鏡觀察。

    (2)菌絲團的刮制方法。在顯微鏡下觀察,根據(jù)第1層(靠近表皮的2~3層細(xì)胞)、第2層(中間3~4層皮層細(xì)胞)和第3層(靠近中柱2~3層細(xì)胞)3個層次分別刮制于盛有無菌水的直徑為60 cm培養(yǎng)皿中。

    (3)菌絲團的選擇及分離培養(yǎng)。在顯微鏡暗視野中找到生長出菌絲的菌絲團或菌絲結(jié),利用1 000 μL的移液槍吸取菌絲團,轉(zhuǎn)接到1 cm2雙抗馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)基塊上,24 ℃恒溫箱培養(yǎng)。

    (4)菌絲團的純化。顯微鏡下鏡檢小塊培養(yǎng)基,將開始生長的菌絲團從小塊培養(yǎng)基上切下,然后轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基,24 ℃恒溫培養(yǎng)。

    1.2.3 菌株鑒定 菌種鑒定依據(jù)菌株菌落的培養(yǎng)特征及菌株顯微形態(tài)觀察的結(jié)果,結(jié)合文獻(xiàn)資料,綜合分析對比相關(guān)特征的異同,最后確定鑒定菌株的分類地位。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 硬葉兜蘭菌根結(jié)構(gòu)

    顯微鏡下觀察硬葉兜蘭根的縱切面和橫切面,從外至內(nèi)依次為根毛(RH)、根被(velamen)、外皮層(exodermis)、皮層(cortex)、內(nèi)皮層(endodermin)和維管柱(vascular cyhinder)。根被組織由4~5層厚壁、多角死細(xì)胞組成,細(xì)胞扁長,排列較松散。外皮層緊貼根被內(nèi)側(cè),由1層細(xì)胞組成,細(xì)胞體積較大,排列也較規(guī)則,其中大部分細(xì)胞為胞壁增厚的死細(xì)胞。皮層由15~17層薄壁細(xì)胞組成,其中靠近外皮層與內(nèi)皮層的 1~2層細(xì)胞體積相對較小,中部的皮層細(xì)胞體積較大,皮層細(xì)胞中含有針狀結(jié)晶和菌根真菌形成的菌絲團。Rasmussen用苯胺藍(lán)對蘭科植物原球莖中的針狀結(jié)晶研究表明,針狀結(jié)晶是植物酸鈣,硬葉兜蘭菌根中的針狀結(jié)晶可能也是這類物質(zhì)[9]。內(nèi)側(cè)靠中柱(VB)的一層是內(nèi)皮層,具有明顯的凱氏帶(casparian strip)。內(nèi)層是維管柱,中柱鞘(pericycle)由1層細(xì)胞構(gòu)成,木質(zhì)部(xylem)與韌皮部(phloem)交替分布(圖1-a至圖1-f)。

    在皮層薄壁組織中清晰地觀察到大量的菌絲團(pelotons)和少量松散的菌絲,菌絲團近橢圓形,皮層細(xì)胞中的菌絲團還通過菌絲穿越細(xì)胞壁(CW)形成菌絲連接(PC)而侵染另一細(xì)胞(圖1-a);菌絲團中或附近也觀察到了念珠狀細(xì)胞(B)(圖1-b);在圖1-c中可以看出菌絲順著根毛進(jìn)入根被。菌絲團中或附近也觀察到了大量的念珠狀細(xì)胞,在皮層細(xì)胞中,菌絲團常常分布在靠近細(xì)胞核(N)的部位,這與范黎等在其他蘭科植物中觀察到的現(xiàn)象[10-11]類似。菌根真菌在皮層細(xì)胞內(nèi)形成菌絲結(jié),可看到皮層細(xì)胞內(nèi)分布著著色棕色或深棕色形態(tài)形狀不規(guī)則的菌絲結(jié)等結(jié)構(gòu),這與丁暉等對蘭花菌根結(jié)構(gòu)研究的結(jié)果[12-13]類似。菌絲團主要分布于皮層細(xì)胞的3~5層中,且非均勻分布于整個橫截面(圖1-e)。皮層細(xì)胞中的菌絲團還通過菌絲穿越細(xì)胞壁而侵染另一細(xì)胞,并再次形成菌絲結(jié)(圖1-a)。而在中柱(微管柱)中既沒有菌絲團,也沒有菌絲。蘭科植物在真菌感染后形成菌絲團等結(jié)構(gòu)是形成共生關(guān)系最直觀、最可靠的證據(jù)。在硬葉兜蘭根的皮層細(xì)胞中明顯觀察到菌絲團、菌絲團之間的菌絲連接、松散的菌絲團以及消解中的菌絲團(DP)(圖1-e),強有力地證明了在自然界硬葉兜蘭與真菌形成典型菌根結(jié)構(gòu),二者為共生關(guān)系。

    2.2 硬葉兜蘭同一根中菌根真菌縱向分布特征

    由表1可知,由根尖向根基部,菌根真菌分離的數(shù)量和種類都有一定的變化特點。首先,從分離數(shù)量的變化上看,由根尖至根基逐漸減少;其次,菌絲團的萌發(fā)活力則是由根尖中菌絲團的分離率13.5%逐漸降至向根基部中菌絲團分離率的8.3%;最后,從分離種類的變化上看,根尖和根中部的種類最多,都為3種,根基部只分布1種菌根真菌。硬葉兜蘭的根基部、中部和根尖部位都有菌根真菌,但其分布由根尖向根基部逐漸減少。

    2.3 硬葉兜蘭同一根中菌根真菌橫向分布特征

    由表2可知,從菌絲團分布上來看,菌絲團大多數(shù)分布于皮層細(xì)胞(皮層中間3~4層細(xì)胞);菌絲團活力上來看,由外皮層向內(nèi)皮層,菌絲團活力逐漸降低,分離率由外皮層及其臨近的1~2層皮層細(xì)胞中菌絲團的分離率20.5%降至內(nèi)皮層及其臨近的1~2層皮層細(xì)胞中菌絲團的分離率0;從種類分布上來看,硬葉兜蘭3年生根皮層中間3~4層細(xì)胞中菌根真菌的種類最多,而第3層(靠近中柱2~3層細(xì)胞)沒有分離到菌根真菌。

    2.4 硬葉兜蘭不同根齡中菌根真菌種類及數(shù)量

    由表3可知,從菌絲團數(shù)量上來看,2年生根菌絲團數(shù)量最多,其次是3年生根,1年生根菌絲團的數(shù)量明顯最少;萌發(fā)生長率與菌絲團的數(shù)量關(guān)系不大,1年生根菌絲團的萌發(fā)率略大于2年生根,3年生其次,但表3的比率差值不大。從菌根真菌種類上來看,2年生根分離的種類最多,1年生根中的菌根真菌種類最少。硬葉兜蘭菌根真菌的種類和數(shù)量隨著根齡的變化而變化,隨著根齡的增加,菌根真菌種類和數(shù)量也相應(yīng)地增加,反之,菌絲團的活力則減少。

    3 討論

    3.1 硬葉兜蘭菌根真菌入侵方式

    顯微結(jié)構(gòu)觀察表明,硬葉兜蘭具有典型的蘭科菌根結(jié)構(gòu)。在皮層細(xì)胞內(nèi)形成菌絲結(jié),菌絲通過穿透細(xì)胞壁侵染鄰近細(xì)胞,并再次形成菌絲結(jié),皮層細(xì)胞中分布著大量的菌絲和菌絲團狀,前者逐漸被植物的根細(xì)胞消解、吸收,而后者會在前者消解之后形成新的菌絲團。這種菌絲被消化又重新定殖的現(xiàn)象在整個植株發(fā)育過程中不斷重復(fù),再次驗證了菌絲團和蘭科植物之間的相互作用,進(jìn)一步肯定了蘭科植物與菌根真菌生長主要營養(yǎng)方式的理論。

    丁暉等曾觀察到,在具有通道細(xì)胞的蘭科植物中,菌絲侵入時常不破壞根被,通過根毛或表皮細(xì)胞及外皮層薄壁通道細(xì)胞直徑侵入[12,14]。在對硬葉兜蘭菌根的觀察中目前只在根毛或表皮細(xì)胞中觀察到菌絲,由此可以認(rèn)為真菌是通過根毛進(jìn)入根被細(xì)胞,進(jìn)一步向通道細(xì)胞和皮層細(xì)胞入侵,但其侵入機制還須要進(jìn)一步深入研究。

    3.2 硬葉兜蘭同一根中菌根真菌縱向分布變化特征

    據(jù)文獻(xiàn)記載,蘭科植物根尖的分生組織有蘭酚類物質(zhì)抵制真菌的侵入[15]。硬葉兜蘭菌根中部的菌根真菌數(shù)量最多,這與春蘭菌根的定植特點相同[16],由此可以看出土壤微生物是先從根中部入侵,隨后向其兩端逐漸蔓延。硬葉兜蘭菌根中部分離到氣生菌絲發(fā)達(dá)的mycorrhizal basidiomycete菌根真菌和氣生菌絲不發(fā)達(dá)的Epulorhiza sp.、Psathyrella candolleana真菌。說明氣生菌絲發(fā)達(dá)和氣生菌絲不發(fā)達(dá)的菌株種類間不具有競爭性,是相互協(xié)同的共生作用。然而,是氣生發(fā)達(dá)菌絲先定殖根皮層細(xì)胞,還是氣生不發(fā)達(dá)菌絲先定殖根皮層細(xì)胞能更好地促進(jìn)蘭科植物的生長,維持長效的共生關(guān)系,這有待下一步的研究。

    3.3 硬葉兜蘭同一根中菌根真菌橫向分布變化特征

    由硬葉兜蘭3年生根菌根真菌的橫向分布的種類和數(shù)量可知,菌根真菌的分離率由外皮層向皮層細(xì)胞逐漸增加,由皮層細(xì)胞向內(nèi)皮層逐漸減少,內(nèi)皮層和中柱細(xì)胞內(nèi)沒有菌絲和菌絲團。經(jīng)過分離培養(yǎng)得出,3個層次的皮層細(xì)胞都以氣生菌絲不發(fā)達(dá)的菌株種類為主,這有助于維持菌根共生關(guān)系,不會因內(nèi)生菌生長過快而導(dǎo)致蘭科植物枯萎。

    3.4 硬葉兜蘭不同根齡中菌根真菌動態(tài)變化特征

    1年生和2年生分離到的5種菌株的氣生菌絲都不明顯,生長較慢,其中Psathyrella candolleana菌株為優(yōu)勢菌,此菌株在雙抗PDA培養(yǎng)基上不形成氣生菌絲且生長較慢,而3年生根分離到的Psathyrella sp.菌株在雙抗PDA培養(yǎng)基上,氣生菌絲發(fā)達(dá),生長速度較快。硬葉兜蘭早期以生長較慢的菌根真菌為主,后期以生長較快的菌根真菌為主;早期以產(chǎn)生少量氣生菌絲為主,后期以產(chǎn)生大量氣生菌絲或氣生菌絲不明顯為主。生長慢的內(nèi)生菌侵入為生長快的內(nèi)生菌創(chuàng)造了較為適宜的生長條件,促進(jìn)生長快的內(nèi)生菌定殖。這樣的定殖方式有助于菌根真菌的協(xié)同作用,促進(jìn)和維持菌根的共生關(guān)系。

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