黃瓜PP2-A1蛋白的生物信息學(xué)分析

龐寧寧 樊懷福 王哲

摘要：韌皮部蛋白2（PP2）是植物特異性的韌皮部蛋白，通過(guò)參與植物調(diào)控其細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平和產(chǎn)物活性來(lái)應(yīng)對(duì)自然界中的各種脅迫，對(duì)于維持植物株體形態(tài)、體內(nèi)物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)和保護(hù)愈合植物傷口有重要意義。以前期克隆得到的黃瓜（Cucumis sativus）PP2-A1蛋白序列為對(duì)象，利用生物信息學(xué)方法，對(duì)黃瓜PP2-A1蛋白序列進(jìn)行生物學(xué)功能分析。結(jié)果表明，黃瓜PP2-A1蛋白具有親水性，比較不穩(wěn)定，半衰期短，無(wú)信號(hào)肽段，沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)，是定位在胞質(zhì)的非分泌蛋白;結(jié)合對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析，得出PP2-A1是以無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈為主的片層結(jié)構(gòu);構(gòu)建PP2的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)其與香瓜親緣關(guān)系最近，同時(shí)預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)功能域，發(fā)現(xiàn)其具有1個(gè)典型的PP2結(jié)構(gòu)功能域。

關(guān)鍵詞：黃瓜;PP2-A1蛋白;分子生物信息學(xué);親水性;系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

中圖分類號(hào)： S642.201 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）02-0046-03

韌皮部蛋白（phloem protein，PP）是從植物韌皮部汁液中提取出來(lái)的能特異性結(jié)合幾丁質(zhì)的一種凝集素[1-2]，植物韌皮部蛋白是通過(guò)調(diào)控植物細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平和產(chǎn)物活性來(lái)應(yīng)對(duì)自然界中的各種脅迫參與到植物生命活動(dòng)中，對(duì)于維持植物株體形態(tài)、內(nèi)體物質(zhì)的運(yùn)轉(zhuǎn)和愈合植物傷口有著重要意義[3]。韌皮部蛋白2（PP2）是韌皮部汁液中最豐富、最神秘的蛋白質(zhì)之一，韌皮部蛋白基因2在植物界的廣泛分布也表明它們?cè)诰S管植物中是古老的、常見(jiàn)的[4]，它是一種二聚體幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素，能夠在同化物流中起轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，并且其中的凝集素活性或RNA結(jié)合特性可以在長(zhǎng)距離上發(fā)揮功能[5-6]。由于篩管不能轉(zhuǎn)錄和翻譯，韌皮部蛋白質(zhì)最可能在緊密連接的伴侶細(xì)胞中合成，并通過(guò)胞間連絲轉(zhuǎn)運(yùn)到篩分元件中[7]。韌皮部液體的特異性蛋白質(zhì)組成表明，這些蛋白質(zhì)不僅對(duì)篩管維持，而且對(duì)于整個(gè)植物的生理和發(fā)育也起了重要的作用[8]。任何不同植物物種的蛋白質(zhì)都可從成熟篩管的汁液中分離出來(lái)，但是迄今為止，僅有少數(shù)已確定其功能特征[9]。

Lee等使用FPLC凝膠過(guò)濾柱從熱處理的擬南芥幼苗的蛋白質(zhì)提取物中提取了幾種韌皮部汁液蛋白，發(fā)現(xiàn)它們從功能上表征了PP2-A1基因，其編碼氨基酸也類似于韌皮部凝集素的蛋白質(zhì)，利用細(xì)菌表達(dá)的AtPP2-A1重組蛋白，發(fā)現(xiàn)其具有雙重功能，即分子伴侶活性和抗真菌活性。在擬南芥防御系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，能夠?qū)垢鞣N外部脅迫，包括真菌病原侵襲和熱休克[10]。前期通過(guò)iTRAQ蛋白組學(xué)的方法研究了鹽脅迫對(duì)于黃瓜韌皮部滲出液蛋白質(zhì)組的影響，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫條件下，黃瓜PP2-A1蛋白的表達(dá)量顯著上調(diào)，推測(cè)這可能是黃瓜韌皮部適應(yīng)逆境脅迫的一種響應(yīng)機(jī)制[11]。本研究通過(guò)分子生物信息學(xué)的方法，研究黃瓜PP2-A1蛋白序列的進(jìn)化情況，并對(duì)黃瓜PP2-A1蛋白的理化特性、跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位情況和二、三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析，旨在了解黃瓜PP2-A1蛋白的基本特性，并預(yù)測(cè)它的功能，為進(jìn)一步揭示PP2-A1基因的防御功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以前期克隆得到的黃瓜（Cucumis sativus）PP2-A1蛋白序列為對(duì)象，利用生物信息學(xué)方法，對(duì)黃瓜PP2-A1蛋白序列進(jìn)行生物學(xué)功能分析。

1.2 方法

1.2.1 理化性質(zhì)分析及疏水性結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 應(yīng)用ExPAsY Protparam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）在線分析工具對(duì)黃瓜PP2-A1蛋白分子量（MW）、等電點(diǎn)（pI）等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析;利用在線軟件ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）預(yù)測(cè)黃瓜PP2-A1蛋白的疏水性結(jié)構(gòu)。

1.2.2 亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽以及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用Signal IP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/performance.php）對(duì)黃瓜PP2-A1蛋白N-末端信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，利用SubLoc V1.0（https：//omictools.com/subloc-tool）對(duì)PP2-A1蛋白分析亞細(xì)胞定位情況;利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.biomedsearch.com/sci/TMHMM-server-v.html）預(yù)測(cè)PP2-A1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)。

1.2.3 糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 應(yīng)用NetNGlyc1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）和NetOGly4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）在線軟件分別對(duì)黃瓜PP2-A1蛋白的N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。利用Net Phos 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Net Phos/）預(yù)測(cè)其磷酸化位點(diǎn)。

1.2.4 二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用ExPAsY SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）軟件對(duì)該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè);使用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/phyre2_output/）軟件同源建模法預(yù)測(cè)目的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 構(gòu)建在線搜索美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)的BlastP（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具，提交黃瓜PP2-A1蛋白序列，BLAST分析目的蛋白同源性序列，找出與黃瓜PP2-A1蛋白同源性高的蛋白序列，應(yīng)用ClustalX程序?qū)Φ鞍仔蛄羞M(jìn)行多序列比對(duì)，采用系統(tǒng)發(fā)育分子進(jìn)化分析軟件MEGA（Ver.5.0），基于Neighbor-Joining distance（鄰近距離法）算法，利用Poisson correct modetionl構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[12]，研究黃瓜PP2-A1蛋白序列發(fā)育情況。

1.2.6 結(jié)構(gòu)域及功能位點(diǎn)預(yù)測(cè) 應(yīng)用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/help/smart_glossary.shtml）在線提交PP2-A1蛋白的氨基酸序列，對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)功能域的功能位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜PP2-A1蛋白的理化性質(zhì)分析及疏水性結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

用ProtParam預(yù)測(cè)分析黃瓜PP2-A1蛋白的理化性質(zhì)，分析結(jié)果顯示，黃瓜PP2-A1蛋白含154個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為17 540.9 u，理論等電點(diǎn)（pI）為7.76，正電荷殘基數(shù)為13個(gè)，負(fù)電荷殘基數(shù)為12個(gè)，總共包含2 419個(gè)原子，分子式為 C787H1 183N223O218S8，黃瓜PP2-A1蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為46.78（>45為不穩(wěn)定），堿性氨基酸賴氨酸含量較高，此蛋白呈弱堿性。蛋白的總平均親水性為-0.184，說(shuō)明蛋白為不穩(wěn)定弱堿性親水蛋白。用在線軟件ProtScale預(yù)測(cè)分析PP2-A1蛋白的疏水性結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果見(jiàn)圖1，親水性/疏水性最小值為-2.456，最大值為1.344，總體表現(xiàn)為親水性。這與之前的分析相互驗(yàn)證。

2.2 黃瓜PP2-A1蛋白的亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽以及跨膜結(jié)構(gòu)分析

典型的跨膜螺旋區(qū)主要是由20～30個(gè)疏水性氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丙氨酸等）組成;親水殘基往往出現(xiàn)在疏水殘基之間，對(duì)蛋白質(zhì)功能有重要的作用。用在線軟件TMHMM Server v. 2.0基于HMM方法的蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測(cè)工具，分析黃瓜韌皮部基因編碼的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該基因編碼的蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，不可能是膜上的受體或定位于膜上。用在線軟件SignalP4.0分析黃瓜凝集素PP2-A1蛋白，最后的計(jì)算結(jié)果為“NO”，表明該基因編碼的蛋白無(wú)信號(hào)肽。通過(guò)在線軟件SubLocV1.0對(duì)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞進(jìn)行定位，分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白可能存在于細(xì)胞周質(zhì)中。

2.3 黃瓜PP2-A1蛋白的糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

N-糖基化是指糖鏈通過(guò)N-乙酰葡萄糖胺連接到蛋白質(zhì)上保守序列N-X-S/T中的天冬酰胺的氨基側(cè)鏈上[13]，結(jié)果如圖2所示，利用NetNGlyc軟件對(duì)其N(xiāo)-糖基化位點(diǎn)分析可知，黃瓜PP2-A1蛋白可能有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別為第21、第77位的天冬酰胺殘基，因此黃瓜PP2-A1蛋白應(yīng)該具有N-糖基化機(jī)制，用NetOGlyc分析軟件對(duì)黃瓜PP2-A1蛋白的O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明黃瓜PP2-A1蛋白沒(méi)有潛在的O-連接糖基化位點(diǎn)。對(duì)黃瓜PP2-A1蛋白的磷酸化位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)（圖3），目的蛋白有4個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、4個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)、1個(gè)酪氨酸位點(diǎn)。

2.4 黃瓜PP2-A1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

PP2-A1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果如圖4所示，圖中由短至長(zhǎng)的豎線依次為無(wú)規(guī)則卷曲、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈、α螺旋。結(jié)果顯示，該蛋白包含43.51%無(wú)規(guī)則卷曲（random coil）、35.70%延伸鏈（extended strand）、13.64α螺旋（alpha helix）、7.14%β轉(zhuǎn)角（beta turn）。因此，黃瓜PP2-A1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中多為無(wú)規(guī)則卷曲和片層結(jié)構(gòu)。

2.5 黃瓜PP2-A1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

用Phyre2在線軟件預(yù)測(cè)黃瓜PP2-A1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，獲得的黃瓜韌皮部凝集素的3D模型如圖5所示，與二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果一致，該蛋白主要由無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈和α螺旋組成。

2.6 構(gòu)建黃瓜PP2-A1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

利用NCBI網(wǎng)站Blastp比對(duì)黃瓜PP2-A1蛋白的同源序列，下載與PP2-A1蛋白相似性較高的甜瓜（Cucumis melo）、南瓜（Cucurbita moschata）、筍瓜（Cucurbita maxima）等物種的氨基酸序列，使用ClustalX2.1軟件對(duì)黃瓜PP2-A1蛋白序列進(jìn)行多序列對(duì)比。運(yùn)用MEGA5.0軟件構(gòu)建基于PP2家族不同氨基酸序列的進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖6所示，可以看出黃瓜

（Cucumis sativus）PP2蛋白與甜瓜PP2蛋白在同一分枝上聚為同一類，相似性為68.18%，說(shuō)明甜瓜與其親緣性較近;其與另一個(gè)分枝上的葫蘆科南瓜屬的日本南瓜（Cucurbita argyrosperma）相似性為27.93%，與筍瓜和金瓜（Cucurbita digitata）的相似性同為27.80%，與南瓜的相似性為25.68%。

2.7 黃瓜PP2-A1蛋白的結(jié)構(gòu)域及功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)

根據(jù)SMART分析結(jié)果顯示，該蛋白具有一個(gè)典型的韌皮部蛋白2功能結(jié)構(gòu)域，在該序列的氨基酸位置為12～153;對(duì)其編碼蛋白的功能位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該序列包含3個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)、1個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（表1）。

3 討論與結(jié)論

基于生物信息學(xué)的角度，利用分子生物信息學(xué)各種相關(guān)軟件的手段，分析黃瓜PP2-A1蛋白序列的生物學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)該蛋白是由20種氨基酸組成的一種不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)，對(duì)PP2-A1蛋白的信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)其不具備信號(hào)肽段，沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)，并且在膜內(nèi)定位的概率幾乎為0，故該蛋白質(zhì)為非分泌非跨膜的膜外（胞質(zhì)）蛋白質(zhì)。分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白質(zhì)中無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈所占的比重較大，結(jié)合對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，證實(shí)了該蛋白質(zhì)的肽鏈主要以無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈為主。有研究表明，無(wú)規(guī)則卷曲經(jīng)常構(gòu)成酶活性部位和特異性功能部位[14]，而研究表明來(lái)自葫蘆科的韌皮部蛋白2是一種表達(dá)量很高的韌皮部蛋白，其mRNA高度保守且具有韌皮部組織特異性，并且能在植物體受到侵害時(shí)發(fā)生韌皮部防衛(wèi)反應(yīng)，對(duì)于抵抗外界環(huán)境中生物以及非生物脅迫具有重要作用[15]。并且由在線軟件分析得出，黃瓜PP2-A1基因編碼的蛋白含有N-糖基化位點(diǎn)，前人研究也表明，韌皮部蛋白2（PP2）是一種優(yōu)先特異結(jié)合N-乙酰氨基葡萄糖寡聚體的、大小為49 ku亞基的二聚體蛋白。經(jīng)過(guò)對(duì)黃瓜PP2-A1蛋白的同源性分析發(fā)現(xiàn)，黃瓜與甜瓜的親緣關(guān)系比較近，與南瓜屬的日本南瓜、筍瓜等比較接近，這與植物傳統(tǒng)分類表上的分類關(guān)系基本一致。同時(shí)分析其結(jié)構(gòu)功能域時(shí)發(fā)現(xiàn)，在12～153有1個(gè)典型的PP2（韌皮部蛋白2）功能域，表明該基因是PP2基因家族的一個(gè)成員。

總之，本研究從生物信息學(xué)角度，以黃瓜PP2-A1基因編碼的蛋白為分析對(duì)象，對(duì)PP2-A1基因推導(dǎo)的氨基酸序列結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)其整個(gè)肽鏈的理化性質(zhì)、疏水性、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位、糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)及其二、三級(jí)結(jié)構(gòu)特征等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并構(gòu)建黃瓜韌皮部蛋白親緣關(guān)系的進(jìn)化樹(shù)，同時(shí)也對(duì)黃瓜PP2-A1蛋白的結(jié)構(gòu)域及功能位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)及探尋黃瓜PP2-A1基因的潛在功能提供參考。利用分子生物信息學(xué)手段，基于已獲得的黃瓜韌皮部蛋白編碼信息，對(duì)黃瓜韌皮部蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)、特征及親緣關(guān)系分析，可增進(jìn)對(duì)黃瓜韌皮部蛋白的認(rèn)識(shí)，利于從分子水平上解釋和挖掘黃瓜韌皮部蛋白的生物功能，為后續(xù)研究黃瓜PP2-A1基因試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

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