無需使用離心機即可快速收獲細胞

文/J.Stephenson，C.Bladen

可一步完成抗體澄清和除菌過濾 // 單克隆抗體被具有極其廣泛的應用，無論是用于基礎研究還是生物制藥。時至今日，收獲哺乳動物細胞培養(yǎng)液依然是項耗時的工作，尤其是在實驗室規(guī)模不大，并且還要涉及離心過程。但如今，采用新式硅藻土過濾解決方案可顯著改善并加快該過程。

單克隆抗體（mAb）被廣泛地應用在生物藥開發(fā)、基礎研究和體外診斷上。單克隆抗體的表達系統(tǒng)通常利用信號肽來確?？贵w分泌到細胞培養(yǎng)基中。雖然該方法可降低純化操作的復雜程度，避免細胞破碎，卻需要使用各種成本昂貴、費時費力的技術(shù)來將細胞與含有抗體的培養(yǎng)液分離。方法通常涉及生產(chǎn)哺乳動物細胞抗體，無論是使用雜交瘤的標準生產(chǎn)，還是使用中國倉鼠卵巢細胞（CHO）或人胚腎細胞系（HEK）的重組生產(chǎn) ，使用的生物反應器規(guī)模一般大于50 L，采用連續(xù)離心和深層過濾等工藝進行操作。

然而，在研究開發(fā)上，通常每種抗體僅需要不到10 L的細胞培養(yǎng)液，因此這些過程不僅成本昂貴，而且不切合實際。所以在研究開發(fā)上使用最廣泛的方法是先使用離心機進行澄清操作，接著使用手動注射器或真空瓶口過濾器將上清液分別注入0.20、0.22或0.45μm 過濾器中進行過濾。該方法經(jīng)濟實惠，易于操作，可與大多數(shù)實驗室中的標準設備配合使用。但是，這些過濾器并非采用深層設計，因此懸浮液中殘留的亞微顆粒易于堵塞過濾器。作為一家專注于抗體表達、測序和工程的公司，Absolute Antibody則使用HEK293和CHO-K1細胞實現(xiàn)重組抗體瞬時表達。

該公司的實驗室每周通?？芍苽?0種抗體，規(guī)模從30 mL到20 L，每周總產(chǎn)量約為100 L細胞。在過去的6年中，實驗室專家一直使用離心后再用瓶口過濾裝置過濾的方法來制備所有抗體。隨著Absolute Antibody產(chǎn)量的提升，對離心機數(shù)量的需求也隨之增加。在此期間，實驗室工程師研究了眾多替代方案，包括使用專為室內(nèi)釀造和絮凝劑（例如幾丁聚糖）而設計的過濾器。這些方法都被證明效率低下，不能滿足實驗需求。

為降低澄清哺乳動物細胞培養(yǎng)液所用的時間和工作量，賽多利斯集團專門研制出了一款Sartoclear Dynamics Lab V 過濾系統(tǒng)。向培養(yǎng)液中添加硅藻土（DE）有助于多孔濾餅成型防止堵塞過濾器，并快速移除樣本中的細胞和細胞碎片，見圖1。因此，該過程中無需離心操作，避免了離心機容量和可用性方面的問題，同時還防止了過濾器堵塞。接著，測試Sartoclear Dynamics Lab V過濾系統(tǒng)，并與公司的標準過程進行比較。

材料和方法

懸浮的HEK293或CHO細胞在無血清培養(yǎng)基中生長，并使用可編碼單克隆抗體的重輕鏈的DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。經(jīng)過6到14天轉(zhuǎn)染后，進行純化操作，可收獲細胞。對于1 L的規(guī)模為例，首先在臺式離心機中按照3.500 kg的重量要求，進行離心操作45 min，并使用1個或多個真空 PES 0.45μm瓶口過濾器進行過濾。將過濾后的上清液加載至具有5 ml蛋白A柱的?KTA蛋白純化儀中，以捕獲抗體，并在低pH緩沖液中洗脫。隨后，中和抗體，并進行其他純化操作（例如，陽離子交換劑或尺寸排阻色譜法）或者直接按照特定批次抗體的要求進行質(zhì)量控制。

質(zhì)量控制手段包括：非還原和還原性SDS-PAGE、SEC-HPLC、內(nèi)毒素檢測，必要時可使用ELISA測量結(jié)合活性，見圖2。

在改進的下游工藝中，可使用Sartoclear Dynamics Lab V代替離心和過濾操作。如果是1 L的細胞培養(yǎng)液，可向其中添加20 g的DE。充分混合細胞和DE后，直接將其添加至 Sartoclear Dynamics Lab包裝中附帶的1000 mL PES 0.22 μm Sartolab RF真空過濾器中。施加真空，并將澄清的細胞培養(yǎng)液收集在1 L的瓶中。按照上述的純化和質(zhì)控過程對濾液進行處理。

圖1 使用常規(guī)過濾和Sartoclear Dynamics Lab過濾方法澄清細胞培養(yǎng)液的原理。

圖2 Absolute Antibody公司生產(chǎn)重組抗體的下游處理工作流程。

結(jié)果與討論

為了將Sartoclear Dynamics Lab V與標準工藝進行對比，可使用HEK293細胞制備2 L的人源化抗EGFR IGG1抗體（西妥昔單抗：Absolute Antibody 產(chǎn)品目錄編號Ab00279-10.0）。經(jīng)過6天的轉(zhuǎn)染后，將培養(yǎng)液平均分成兩份。細胞收獲時，細胞密度為2.4×106cells/mL，存活率為65%。

使用常規(guī)工藝方法對其中1L細胞培養(yǎng)液進行處理，包括45 min的離心操作，接著使用三個0.45μm PES 500 mL瓶口過濾器進行過濾。這些過濾器通常在過濾了400 mL上清液后出現(xiàn)堵塞，意味著每升細胞培養(yǎng)液平均需要三個過濾器。該過程中并未使用孔徑大小為0.22μm的過濾器，以便在發(fā)生堵塞前提高上清液的過濾容量。過濾1L細胞需要9 min，其中包括48 s的手動操作時間，因此將整體工藝時間延長至約55min。

使用Sartoclear Dynamics Lab V處理另外1 L細胞培養(yǎng)液。將兩袋10 g的DE加入細胞中，然后充分混合。將細胞倒入1000 mL 0.22μm Sartolab RF過濾器中并施加真空。整個過濾過程中并未出現(xiàn)堵塞，從添加DE到完成過濾，總計耗時8 min27 s。這表明該方法大約只需傳統(tǒng)方法處理時間的15%，如圖3所示。

圖3 根據(jù)處理時間對比澄清操作。

為了確認Sartoclear Dynamics Lab V工藝對抗體質(zhì)量無影響，分別使用兩個樣本進行純化和質(zhì)量控制。最后純化后的抗體顯示，使用SDS-PAGE,見圖5(在線）或SECHPLC，見圖6（在線）確認并未檢測到產(chǎn)品差異。測量每種樣本的內(nèi)毒素，兩者的讀數(shù)均小于0.05 EU/mg，這是使用試劑盒通常會檢測到的最低下限。

為了確認改進后的工藝對抗體功能無影響，使用間接ELISA以展示人體EGFR-Fc間的結(jié)合性（Absolute Antibody 產(chǎn)品目錄編號Pr00117-10.9）。如圖4所示，細胞澄清方法對結(jié)合活性無影響。此外，兩種方法所獲得最終產(chǎn)量幾乎相同，表明DE對抗體的質(zhì)量和數(shù)量無影響。

LP本刊提示

無需離心操作即可輕松過濾

Sartoclear Dynamics Lab是一種創(chuàng)新解決方案，適用于在實驗室中預過濾掉細胞培養(yǎng)液的細胞碎片后再進行除菌過濾。采用Sartoclear Dynamics Lab提供的解決方案可一次性完成哺乳動物細胞培養(yǎng)液澄清和除菌過濾。該即用型產(chǎn)品完全無需進行離心操作，因此可簡化澄清過程。利用該技術(shù)可在幾分鐘內(nèi)高效澄清并對細胞培養(yǎng)液進行除菌操作。

結(jié)論

Sartoclear Dynamics Lab V可快速澄清哺乳動物細胞培養(yǎng)液，無需離心操作。使用抗體瞬時轉(zhuǎn)染兩升的細胞培養(yǎng)液，然后分別使用基于標準離心澄清工藝和基于硅藻土方法進行處理后對比，可得出上述結(jié)論。

使用一系列測量方法（SDSPAGE, SEC-HPLC, ELISA和內(nèi)毒素）確認最終產(chǎn)品的數(shù)量或質(zhì)量，并未檢測到任何有意義的差異，表明基于硅藻土的方法對產(chǎn)品質(zhì)量無影響。重要的是，Sartoclear Dynamics Lab V 工藝可顯著節(jié)省約85%的時間。這使得Sartoclear Dynamics Lab V成為頗具吸引力的選擇，可提高澄清分泌蛋白質(zhì)表達和純化系統(tǒng)的生產(chǎn)效率和通量。