桑樹桑黃發(fā)酵菌粉在新型培養(yǎng)方法下的性能分析*

高麗霞

（河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 宜州 546300）

桑黃Phellinus igniarius.，別名火木層孔菌、針層孔菌、桑耳、鮑氏層孔菌、針裂蹄。與擔(dān)子菌綱多孔菌目多孔菌科層孔菌的屬性相同[1]。通常生長在楊樹、桑樹、柳樹、白樺樹等闊葉樹上。桑黃具備較好的化瘀功能，中醫(yī)領(lǐng)域通常會(huì)用它處理血崩、血淋等病癥[2]。受到寄生樹種差異性的影響，桑黃性狀具有一定區(qū)別[3]。國外相關(guān)研究人員認(rèn)為，生長在桑樹上且樹齡大于30年的桑黃即為正品桑黃，藥性較優(yōu)。正品桑黃顏色尤其鮮黃，以淡黃色為主。隨著桑黃需求量逐漸增多，市場價(jià)格也逐漸提升，導(dǎo)致每個(gè)產(chǎn)地桑黃都被大肆開采，且桑樹容易感染青枯病，桑樹桑黃便逐漸出現(xiàn)供不應(yīng)求的情況[4-5]。因此，人工栽培與發(fā)酵培養(yǎng)桑黃，是桑黃培養(yǎng)問題的重中之重。發(fā)酵菌粉具有生產(chǎn)時(shí)間短、生產(chǎn)速度快的優(yōu)勢，是獲取桑黃這種珍稀藥用真菌成本最低、最為便捷的方法。隨著植物基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，新型桑樹的產(chǎn)量出現(xiàn)量的提升?？瓜x、抗病等基因的引入，會(huì)提升桑樹的產(chǎn)量以及桑黃的質(zhì)量[6-7]。將抗菌肽基因?qū)肷涿纾@取抗病新型桑樹苗，提升桑樹苗的抗病性，并研究發(fā)酵新型桑樹苗提取新型桑樹桑黃發(fā)酵菌粉，確保新型桑樹的優(yōu)良性狀得以遺傳。

1 抗病新型桑樹的培養(yǎng)

1.1 新型桑樹苗的培養(yǎng)

1.1.1 子葉

實(shí)驗(yàn)品種是豐馳桑[8]。它的種子根據(jù)常規(guī)方法采集后，放置6℃溫度下儲(chǔ)存。使用時(shí)獲取合適的分量在室溫下浸泡1 d[9]，再放置流水里沖洗40 min，采用70%乙醇進(jìn)行6 min左右的消毒，然后使用0.2%HgCl2消毒30 min，通過無菌水多次清洗后放在無菌濾紙上進(jìn)行干燥處理，放置1/2 MS培養(yǎng)基中，在黑暗環(huán)境中放置2 h左右，提取子葉。

1.1.2 農(nóng)桿菌

所用農(nóng)桿菌（Agrobacterium） 是載體pTYB的胭脂堿型農(nóng)桿菌。pTYB載體具備嶄新的抗菌肽shivA基因。此菌在具有四環(huán)素20 mg·L-1與卡那霉素40 mg·L-1的LB液體培養(yǎng)基里振動(dòng)培養(yǎng)24 h。菌液通過4 000 r·min-1離心10 min，使用MS1液體培養(yǎng)基稀釋后便可使用[6]。

1.1.3 轉(zhuǎn)化處理

將上述提取的子葉使用稀釋后的農(nóng)桿菌浸泡15 min（對照組的子葉采用MS1液體培養(yǎng)基浸泡15 min），將子葉放在無菌濾紙上去除無關(guān)菌液，再放置具有2層無菌濾紙的MS1固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h。

1.1.4 篩選培養(yǎng)

子葉培養(yǎng)4 h后，放置具有羧芐青霉素（Cd）與卡那霉素（Km）的MSI培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)換細(xì)胞獲取不定芽。等不定芽生長到3 cm~4 cm時(shí)，把它放置在具有 Cb 60 mg·L-1與 Km 20 mg·L-1的培養(yǎng)基里培養(yǎng)生根。

1.1.5 DNA點(diǎn)雜交

雜交探針的標(biāo)識(shí)根據(jù)Promega試劑盒說明書實(shí)行，獲取新型桑樹苗。

1.1.6 培養(yǎng)基

MS1培養(yǎng)基里存在8 p維生素、6-BA（6-芐氨基腺嘌呤） 4.0 mg·L-1、IAA （吲哚乙酸） 0.4 mg·L-1、葡萄糖40 g·L-1、以及具有水解乳蛋白500 mg·L-1的MS培養(yǎng)基；MS2培養(yǎng)基中具有6-BA 2.0 mg·L-1。

1.2 新型桑樹抗病性測定

1.2.1 抗病性測試方法

獲取的新型桑樹苗一部分放置土壤里，等其生長至50 cm時(shí)，實(shí)行青枯病菌針刺接種，剩余部分采用1/3 MS無機(jī)鹽溶液實(shí)行無土栽培方式，實(shí)驗(yàn)試菌屬于桑青枯病順德型菌株。青枯菌培養(yǎng)48 h后，采用滅菌蒸餾水配比濃度依次是1×108個(gè)/mL、5×108個(gè)/mL、1×109個(gè)/mL的菌液，并采用滅菌水設(shè)成空白對照。

1.2.2 抗病性測定結(jié)果

新型桑樹抗病性測定結(jié)果見表1。

表1 新型桑樹抗病性測定結(jié)果Tab.1 Determination of disease resistance of new mulberry trees

表1中，青枯菌（1）、青枯菌（2）、青枯菌（3）分別表示濃度依次是1×108個(gè)/mL、5×108個(gè)/mL、1×109個(gè)/mL的菌液。

分析表1數(shù)據(jù)可知，滅菌水的影響下，對照苗與新型苗的各項(xiàng)測定指標(biāo)數(shù)都相同，在引進(jìn)不同濃度的青枯菌后，對照苗的成活數(shù)為0，新型苗的最多成活數(shù)4株；對照苗的成活率為0，新型苗的成活率最低是12.6%。這是因?yàn)樾滦蜕涿缋锏目咕挠行б种魄嗫菥纳L，桑樹的抗病性增強(qiáng)，成活率得以提升，產(chǎn)量也會(huì)增多。

2 新型桑樹桑黃發(fā)酵菌粉的性能分析

2.1 新型桑樹桑黃發(fā)酵菌粉的提取

將2.1方法獲取的新型桑樹苗進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)的過程是：液體新型樹苗培養(yǎng)基500 mL轉(zhuǎn)入1 L搖瓶內(nèi)，在27℃、125 r·min-1轉(zhuǎn)速以及12%接種量的情況下，實(shí)施新型桑樹桑黃發(fā)酵菌發(fā)酵培養(yǎng)。采用布氏漏斗對發(fā)酵液進(jìn)行過濾后進(jìn)行清水沖洗，最后放到60℃烘箱烘干，提取新型桑樹桑黃發(fā)酵菌粉。

2.2 新型桑樹桑黃發(fā)酵菌粉的成分分析方法

2.2.1 氨基酸成分分析方法

依次稱取新型的桑樹桑黃子發(fā)酵菌粉與原始桑樹桑黃子實(shí)體，通過7 mol·L-1HCl，110℃酸解22 h之后，采用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行試驗(yàn)[10]。

2.2.2 礦物元素分析

借鑒GB 7887-1987，采用原子吸收分光光度儀測試礦物元素。

2.2.3 pH值

用pH計(jì)測量。

2.3 氨基酸對比分析結(jié)果

原始桑樹桑黃子實(shí)體與新型桑黃發(fā)酵菌粉的氨基酸對比分析結(jié)果見表2。

分析表2數(shù)據(jù)可知，原始桑樹桑黃子實(shí)體中氨基酸總含量為9.89%，桑黃發(fā)酵菌粉中氨基酸含量為28.31%。由此可知，原始桑樹桑黃子實(shí)體中氨基酸雖低于新型桑黃發(fā)酵菌粉中氨基酸含量，但原始桑樹桑黃子實(shí)體與新型桑黃發(fā)酵菌粉中氨基酸種類都具有多樣化，且結(jié)構(gòu)相似，新型方法可行。

2.4 礦物元素分析結(jié)果

表3是原始桑樹桑黃子實(shí)體與新型桑黃發(fā)酵菌粉礦元素對比分析結(jié)果。

表2 原始桑樹桑黃子實(shí)體與新型桑黃發(fā)酵菌粉的氨基酸對比分析結(jié)果Tab.2 Comparative analysis of amino acids between original Phellinus igniarius fruiting body and new Phellinus igniarius fermentation powder

表3 原始桑樹桑黃子實(shí)體與新型桑黃發(fā)酵菌粉礦元素對比分析結(jié)果Tab.3 Comparative analysis of elements between the original Phellinus igniarius fruit body and the new type of Phellinus igniarius fermentation powder

分析表3數(shù)據(jù)可知，原始桑黃子實(shí)體和新型桑黃發(fā)酵菌粉里都具備人體必需的8種礦物質(zhì)元素。此8種礦物質(zhì)元素對造血、細(xì)胞生長、酶活性激發(fā)、蛋白質(zhì)合成等都具有關(guān)鍵影響。且新型桑黃發(fā)酵菌粉里的Ca、Na、Fe、Zn、Mg含量都多于原始桑黃子實(shí)體里的含量，結(jié)構(gòu)相似，該方法可行。

2.5 最佳碳源、氮源不同含量組合對桑樹桑黃發(fā)酵菌粉的影響

針對新型培養(yǎng)過程中不同碳源和氮源，對桑樹桑黃發(fā)酵菌粉產(chǎn)量的影響進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)研究，通過桑樹桑黃發(fā)酵菌粉的產(chǎn)量提取合適的碳氮比，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 碳源、氮源含量對桑樹桑黃發(fā)酵菌粉產(chǎn)量的影響Tab.4 Effects of carbon and nitrogen sources on the yield of Phellinus igniarius fermentation powder

分析表4數(shù)據(jù)可知，低氮配比時(shí)，碳源含量越多，桑樹桑黃發(fā)酵菌粉的產(chǎn)量越多；但高氮配比中桑樹桑黃發(fā)酵菌粉產(chǎn)量不是很客觀。低碳配比時(shí)，桑樹桑黃發(fā)酵菌粉產(chǎn)量也與氮含量的多少有關(guān)?？偠灾?，碳含量固定的前提下，高氮含量會(huì)干擾桑樹桑黃發(fā)酵菌粉產(chǎn)量；氮含量固定的前提下，高碳含量不會(huì)干擾桑樹桑黃發(fā)酵菌粉產(chǎn)量，但產(chǎn)量增長較小。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，在0.60%的氮源和4.00%的碳源條件下，桑樹桑黃發(fā)酵菌粉產(chǎn)量最多，而0.60%的氮源和3.00%的碳源條件下，桑樹桑黃發(fā)酵菌粉產(chǎn)量也很多，和最大產(chǎn)量的差距可忽視不計(jì)。所以，在節(jié)省制作成本的考慮下，最合適的碳氮含量是0.60%的氮源和3.00%的碳源。

2.6 不同起始pH值對桑樹桑黃發(fā)酵菌粉的干擾

將新型培養(yǎng)的起始pH值設(shè)定5種不同程度以及1個(gè)對照組，對照組是將桑黃發(fā)酵菌培養(yǎng)基導(dǎo)入自來水，衍生出自然pH值（5.91）。起始pH值試驗(yàn)培養(yǎng)設(shè)定是：溫度28℃，轉(zhuǎn)速為140 r·min-1，接種量20%，260 mL三角瓶裝培養(yǎng)液110 mL，培養(yǎng)時(shí)間是8 h。試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 不同起始pH值對桑樹桑黃發(fā)酵菌粉的干擾結(jié)果Tab.5 Effect of different initial pH values on Phellinus igniarius Fermentation Powder

分析表5數(shù)據(jù)可知，桑黃發(fā)酵菌在弱酸性培養(yǎng)液里生產(chǎn)情況比較樂觀，但在酸性培養(yǎng)液里生長較為困難；當(dāng)pH值為8.51時(shí)，桑黃發(fā)酵菌粉干重僅為0.41 g·mL-1；pH值是6.51時(shí)，桑黃發(fā)酵菌粉干重為2.55 g·mL-1，此時(shí)桑黃發(fā)酵菌粉干重最高。對照組酵菌粉pH未經(jīng)調(diào)整時(shí)，桑樹桑黃發(fā)酵菌粉干重為2.47 g·mL-1，也較高。由此可知，在新型培養(yǎng)桑黃酵菌時(shí)，可不調(diào)整pH值。分析培養(yǎng)結(jié)束的pH值可知，桑黃發(fā)酵菌對環(huán)境的適應(yīng)能力較好，若所在環(huán)境存在一定不適時(shí)，自身能夠調(diào)整局部環(huán)境獲取自身所需最優(yōu)pH值。

3 結(jié)論

本文用抗菌肽基因轉(zhuǎn)化桑樹，獲取新型桑樹苗，通過測試結(jié)果驗(yàn)證新型桑樹苗抗病性較強(qiáng)，將新型桑樹苗發(fā)酵后提取新型桑樹桑黃發(fā)酵菌粉，與原始桑樹桑黃子實(shí)體相比，新型桑樹桑黃發(fā)酵菌粉與其結(jié)構(gòu)相似，新型桑黃發(fā)酵菌粉中的Ca、 Na、Fe、Zn、Mg含量較多，說明桑樹桑黃發(fā)酵菌粉的新型培養(yǎng)，具有較高營養(yǎng)價(jià)值和開發(fā)價(jià)值。為了降低成本，選用的最合理碳氮含量是0.6%的氮源和4%的碳源。桑黃發(fā)酵菌在弱酸性環(huán)境中的產(chǎn)量更高，桑黃發(fā)酵菌對環(huán)境的適應(yīng)能力較好，若所在環(huán)境存在一定不適時(shí)，自身能夠調(diào)整局部環(huán)境獲取自身所需最優(yōu)pH值。

雖然桑樹基因工程的分析工作持續(xù)多年，也獲取一定成果。但是桑樹外源基因的表達(dá)轉(zhuǎn)化率低，導(dǎo)致新型植株的高效、優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)具有相應(yīng)的難度，所以，未來還需更多科技工作者深層次的去探索。