miR-138調(diào)節(jié)SIRT1p-STAT3通路抑制高糖誘導腎小球系膜細胞炎性反應及纖維化

丁國明 鄭壽浩 戢 晴 阮 園

糖尿病腎病是糖尿病的重要并發(fā)癥，屬于糖尿病慢性并發(fā)癥中的微血管病，其機制與細胞外基質(zhì)沉積過多、腎小球系膜細胞肥大、基膜增厚、腎小球與腎間質(zhì)發(fā)生纖維化改變有關(guān)。微小RNA(microRNA，miRNA)是長約22nt的非編碼RNA，能夠與mRNA結(jié)合阻斷蛋白編碼基因的表達，進而實現(xiàn)對轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控[1～3]。miR-138能促進過氧化物酶受體的表達，促進體內(nèi)脂肪細胞分化[4]。同時miR-138可促進轉(zhuǎn)化生長因子 β(TGF-β)受體和及Ⅳ型膠原的表達,加重腎臟纖維化程度，激活單核細胞、補體系統(tǒng)，增加細胞因子釋放，介導內(nèi)皮功能紊亂，暴露膠原組織，加速血小板附著和聚集，加劇腎臟損傷程度[5，6]。

SIRT1是Ⅲ類去乙?；附M蛋白的成員，通過去乙?；臀⒄{(diào)蛋白質(zhì)因子(包括內(nèi)皮型一氧化氮合成酶)的活性，參與衰老、代謝和對氧化應激的耐受性[7]。SIRT1通過抑制血管生成和減少動脈內(nèi)壁脂質(zhì)沉淀，成為血腎小球血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[8]。P-STAT3是SIRT1 mRNA靶向非翻譯區(qū)(UTR)的結(jié)合分子，具有促進炎性、纖維化因子結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)、纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)高表達的作用[9,10]。目前關(guān)于糖尿病腎病與miR-138、SIRT1p-STAT3調(diào)節(jié)機制的研究較少。本研究擬探討miR-138調(diào)節(jié)SIRT1p-STAT3通路抑制高糖誘導腎小球系膜細胞炎性反應及纖維化，為糖尿病腎病的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

資料與方法

1.細胞來源、儀器與試劑:大鼠腎小球系膜細胞株(中國科學院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細胞庫)、DnJ-4249CO2培養(yǎng)箱(美國Revco公司)、RPMI1640 培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher Scientific公司)、胰酶(德國Merck公司)、四甲基偶氮唑藍(北京廣源恒信科技發(fā)展有限公司)、99.99%葡萄糖(美國Thermo公司)、Lipofectamine2000 脂質(zhì)體(美國Invitrogen公司)、miRNA-138-mimics、序列：5′-CCAGUCAGUUCCUGAUGCAGUA-3′、NG+miRNA-138(沉默)-mimics序列：5′-GAUGUCAGUUCCAUCGUUGCUCAG-3′(上海伯豪生物技術(shù)有限公司)、吖啶橙(中國碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品)、胎牛血清(美國康寧公司)、Trizol試劑(美國Invitrogen Thermo Fisher Scientifc公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒(英國Cambridge公司)、FCRL5基因的表達測定采用UltraSYBR One Step RNA PCR Kit(寶生物工程大連有限公司)、實時熒光定量PCR儀(美國熱電公司)、NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測儀(美國Thermo公司)、SIRT1、P-STAT3、CTGF、ET-1、FN蛋白 Elisa 試劑盒(德國Merck公司)、DMI3000 B倒置顯微鏡(德國Leica公司)、MK3酶標儀(美國 Thermo公司)、恒溫培養(yǎng)箱grp-9080(美國通用公司)二氧化碳培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技中國有限公司)、超凈工作臺(上海恒躍醫(yī)療器械有限公司)。

2.細胞復蘇培養(yǎng)、分組設(shè)計及轉(zhuǎn)染情況檢測

(1)細胞復蘇培養(yǎng)：將裝有大鼠腎小球系膜細胞株的凍存管從液氮中取出，37℃水浴箱迅速解凍，吸取菌液至5ml EPP無菌管中，1500r/min，離心5min，上清液吸棄，加入pH值為7.2含10%胎牛血清、鏈霉素100μg/ml、青霉素100μg/ml、的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，3天換液，當細胞融合率達到80%時，用0.5%胰蛋白酶消化傳代。

(2)分組設(shè)計:正常濃度葡萄糖組(4.0mmol/L，normal glucose，NG)、 高濃度葡萄糖組(40.0mmol/L，high glucose,HG)：取5ml大鼠腎小球系膜細胞液(細胞濃度為5×106/ml)于10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，分別加入5ml 8.0mmol/L、80.0mmol/L的無菌葡萄糖溶液，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2、20%O2)。NG+miRNA-138沉默組、NG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組：取5ml大鼠腎小球系膜細胞液(細胞濃度為5×106/ml)于10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，分別加入5ml轉(zhuǎn)染miRNA-138-mimics、NG+miRNA-138(沉默)-mimics以及10ml 8.0mmol/L的無菌葡萄糖溶液，轉(zhuǎn)染按照美國Invitrogen公司 Lipofectamine2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。HG+miRNA-138沉默組、HG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組：取5ml大鼠腎小球系膜細胞液(細胞濃度為5×106/ml)于10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，分別加入5ml轉(zhuǎn)染miRNA-138-mimics、NG+miRNA-138(沉默)-mimics以及10ml 80.0mmol/L的無菌葡萄糖溶液，轉(zhuǎn)染按照美國Invitrogen公司 Lipofectamine2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。

(3)轉(zhuǎn)染情況檢測:即用型免疫組化法進行轉(zhuǎn)染情況檢測，miRNA-138-mimics轉(zhuǎn)染細胞核內(nèi)有明顯的棕黃色顆粒, 而miRNA-138沉默細胞核被蘇木素復染成藍色。以上各組每孔設(shè)6個平行樣，培養(yǎng)72h。

3.各組大鼠腎小球系膜細胞株miRNA138 RNA水平的檢測:取5ml細胞液(細胞濃度為5×106/ml)，5000r/min離心5min，miRNeasy Mini試劑盒(美國Qiagen公司)提取總RNA，NanoDrop1000(美國NanoDrop公司)定量RNA純度。TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒(美國Applied Biosystems公司)進行RT反應。為合成cDNA，將反應混合物依次在16℃下孵育30min，在42℃下孵育30min，在85℃下孵育5min。參照GenBank 數(shù)據(jù)獲取 2 個基因多態(tài)性位點的序列，設(shè)計待測基因位點的PCR擴增引物和單堿基延伸引物(參照http：//links.lww.com/MD/A675)，按20μl模板和10μl 反應液構(gòu)成 PCR反應體系， 擴增程序: 95℃ 5min; 93℃10s，61℃ 30s，重復 40個循環(huán)，61℃時采集熒光(表1、表2)。實時熒光定量 PCR儀檢測其表達量。

表1 miRNA-138、β-actin RNA引物序列

表2 RT-PCR反應體系

4.各組大鼠腎小球系膜細胞株SIRT1、P-STAT3、CTGF、ET-1、FN、TGF-β1、VEGF蛋白水平測定:染毒結(jié)束后，5000r/min離心收集各組細胞，加入PBS制成細胞懸液后，酶聯(lián)免疫吸附法測定培養(yǎng)液中SIRT1、P-STAT3、CTGF、ET-1、FN、TGF-β1、VEGF蛋白水平。

結(jié) 果

1.各組細胞miRNA-138 RNA、SIRT1、P-STAT3水平比較:由表3可見，HG組miRNA-138 RNA、P-STAT3水平高于NG組，SIRT1水平低于NG組(P<0.05)；NG+miRNA-138沉默組miRNA-138 RNA、P-STAT3水平低于NG組，SIRT1水平高于NG組(P<0.05)；NG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組miRNA-138 RNA、P-STAT3水平高于NG組，SIRT1水平低于NG組(P<0.05)；NG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組miRNA-138 RNA、P-STAT3水平高于NG+miRNA-138沉默組，SIRT1水平低于NG+miRNA-138沉默組(P<0.05)；HG+miRNA-138沉默組miRNA-138 RNA、P-STAT3水平低于HG組，SIRT1水平高于HG組(P<0.05); HG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組miRNA-138 RNA、P-STAT3水平高于HG組，SIRT1水平低于HG組(P<0.05)；HG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組miRNA-138 RNA、P-STAT3水平高于HG+miRNA-138沉默組(P<0.05)。

表3 各組細胞miRNA-138 RNA、SIRT1、P-STAT3水平比較

與NG組比較,*P<0.05；與NG+miRNA-138沉默組比較,#P<0.05；與HG組比較,ΔP<0.05；與HG+miRNA-138沉默組比較,▲P<0.05

2.各組細胞炎性因子TGF-β1、VEGF水平比較：由表4可見，HG組TGF-β1、VEGF水平高于NG組；NG+miRNA-138沉默組TGF-β1、VEGF水平低于NG組(P<0.05)；NG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組TGF-β1、VEGF水平高于NG組(P<0.05)；NG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組TGF-β1、VEGF水平高于NG+miRNA-138沉默組(P<0.05)；HG+miRNA-138沉默組TGF-β1、VEGF水平低于HG組(P<0.05); HG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組TGF-β1、VEGF水平高于HG組(P<0.05)；HG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組TGF-β1、VEGF水平高于HG+miRNA-138沉默組(P<0.05)。

表4 各組細胞炎性因子TGF-β1、VEGF水平比較

與NG組比較,*P<0.05；與NG+miRNA-138沉默組比較,#P<0.05；與HG組比較,ΔP<0.05；與HG+miRNA-138沉默組比較,▲P<0.05

3.各組細胞纖維化因子CTGF、ET-1、FN水平比較:由表5可見，HG組CTGF、ET-1、FN水平高于NG組；NG+miRNA-138沉默組CTGF、ET-1、FN水平低于NG組(P<0.05)；NG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組CTGF、ET-1、FN水平高于NG組(P<0.05)；NG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組CTGF、ET-1、FN水平高于NG+miRNA-138沉默組(P<0.05)；HG+miRNA-138沉默組CTGF、ET-1、FN水平低于HG組(P<0.05); HG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組CTGF、ET-1、FN水平高于HG組(P<0.05)；HG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組CTGF、ET-1、FN水平高于HG+miRNA-138沉默組(P<0.05)。

表5 各組細胞纖維化因子CTGF、ET-1、FN水平比較

與NG組比較,*P<0.05；與NG+miRNA-138沉默組比較,#P<0.05；與HG組比較,ΔP<0.05；與HG+miRNA-138沉默組比較,▲P<0.05

4.SIRT1p-P-STAT3通路各指標相關(guān)性分析:由表6可見，miRNA-138與SIRT1呈負相關(guān)(P<0.01)，SIRT1與P-STAT3呈負相關(guān)(P<0.05)，P-STAT3與CTGF、ET-1、FN、TGF-β1、VEGF呈正相關(guān)(P<0.05)。

表6 SIRT1p-P-STAT3通路各指標相關(guān)性分析

討 論

大量證據(jù)表明microRNAs的失調(diào)與細胞炎癥、纖維化反應有關(guān)[11]。miR-138通過細胞凋亡途徑PI3K/AKT抑制肌纖維細胞炎癥。miR-143充當平滑肌細胞和HUVEC之間的通信分子，抑制HUVEC纖維化反應[12]。miR-155通過抑制細胞特異性靶基因在內(nèi)皮炎癥、纖維化反應過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)生成作用。

研究表明，miR-138是腎小球系膜細胞的損害因子。最近的一項研究表明，高糖水平誘導的miR-138過表達是腎小球系膜細胞保護因子SIRT1的負調(diào)節(jié)因子，其通過內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)減少一氧化氮的產(chǎn)生[13,14]。本研究結(jié)果顯示，HG、NG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組TGF-β1、VEGF、CTGF、ET-1、FN水平高于NG組；NG+miRNA-138沉默組TGF-β1、VEGF、CTGF、ET-1、FN水平低于NG組； NG+miRNA-138、HG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組TGF-β1、VEGF、CTGF、ET-1、FN水平高于NG+miRNA-138沉默組；HG+miRNA-138沉默組TGF-β1、VEGF、CTGF、ET-1、FN水平低于HG組; HG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組TGF-β1、VEGF、CTGF、ET-1、FN水平高于HG組；說明高糖誘導的腎小球系膜細胞miR-138的表達增加，能明顯增強炎癥、纖維化反應，進一步就miR-138致炎癥、纖維化機制進行研究。結(jié)果顯示，miR-138負向調(diào)控SIRT1，SIRT1是腎小球系膜細胞保護因子，其能抑制腎小球系膜細胞損害過程中伴隨的炎癥、纖維化反應。

國外研究表明，SIRT1能下調(diào)促炎細胞因子單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)和IL-1b、ET-1、FN[15]。通過抑制SIRT1的表達，雷帕霉素靶蛋白(mTOR)已顯示出促進腎小球系膜細胞炎癥、纖維化反應的能力[16]。結(jié)合本研究結(jié)果中，SIRT1與TGF-β1、VEGF、CTGF、ET-1、FN呈負相關(guān)，筆者推測高糖水平破環(huán)SIRT1的正常表達而促進TGF-β1、VEGF、CTGF、ET-1、FN過表達，進而加劇腎小球系膜細胞炎癥、纖維化反應。P-STAT3是炎癥、纖維化反應的響應細胞因子和生長因子，STAT3被受體磷酸化，形成同源二聚體或異源二聚體，轉(zhuǎn)移至細胞核，發(fā)揮調(diào)控作用，在膠質(zhì)母細胞瘤的體外增殖實驗中，SIRT1磷酸化p-STAT3促進VEGF、IL-6、FN的分泌[17，18]。此外，SIRT1也抑制了HepG2細胞中p-STAT3的表達。在本研究中，SIRT1與P-STAT3呈負相關(guān)，SIRT1對p-STAT3蛋白的表達具有抑制作用 ，與上述結(jié)果一致，提示SIRT1可能通過抑制p-STAT3蛋白表達而起到高糖促進腎小球系膜細胞炎性反應及纖維化。

本研究結(jié)果表明，miR-138在介導高糖誘導腎小球系膜細胞炎性反應及纖維化過程中起重要作用。 研究發(fā)現(xiàn)miR-138通過調(diào)控細胞炎性因子TGF-β1、VEGF水平以及纖維化因子CTGF、ET-1、FN水平參與高糖誘導腎小球系膜細胞損害。作為miR-138的直接靶分子，SIRT1過表達能起到保護減輕氧化應激反應，抑制腎臟纖維化的作用，由SIRT1介導的pSTAT3蛋白表達的調(diào)節(jié)也是高糖誘導腎小球系膜細胞損害的原因。 因此，本研究初步表明高糖能誘導miR-138水平過表達，抑制SIRT1表達，進而p-STAT3、TGF-β1、VEGF、CTGF、ET-1、FN高水平表達，導致腎小球系膜細胞炎性反應及纖維化。

綜上所述，miR-138促進高糖誘導的腎小球系膜細胞炎性反應及纖維化，其機制與抑制SIRT1引起的P-STAT3的磷酸化、導致TGF-β1、VEGF、CTGF、ET-1、FN高表達有關(guān)。