一種中性普魯蘭酶的高效表達(dá)及重組酶在粉絲制作中的應(yīng)用

王婕，朱新文，德青美朵，姚雁，沈微,*，陳獻(xiàn)忠，樊游

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(無錫先秦生物科技有限公司，江蘇 無錫，214073)3(江南大學(xué)，中國高校工業(yè)微生物資源數(shù)據(jù)平臺，江蘇 無錫，214122)

粉絲是我國具有悠久歷史的傳統(tǒng)美食，深受各族人民的喜愛。傳統(tǒng)的粉絲制作原料主要是綠豆淀粉，近年來由于綠豆價格上漲，以薯類淀粉為原料的粉絲市場占有量不斷上升。傳統(tǒng)的薯類淀粉粉絲生產(chǎn)工藝一般需要加入明礬，以提高粉絲的韌性。過量攝入明礬會損害人體健康[1]，因此尋找合適的明礬替代物是一個關(guān)系我國人民群眾健康的重要研究課題。近年來研究者嘗試了黃原膠、魔芋膠、復(fù)合磷酸鹽等多種明礬替代物[2-5]，這在一定程度上解決了明礬的問題。本文作者在前期工作中通過用普魯蘭酶處理芡糊，建立了一種完全不使用明礬的薯類淀粉粉絲制作方法，所制作的粉絲質(zhì)量與添加明礬的粉絲基本一致[6]。普魯蘭酶的處理可以提高芡糊中直鏈淀粉的含量，這可能是其提高粉絲質(zhì)量的關(guān)鍵原因。有研究表明直鏈淀粉溶液在溫度下降時發(fā)生不可逆凝膠化和結(jié)晶，形成淀粉的短期回生現(xiàn)象[7-8]?；厣欠劢z制作中的重要環(huán)節(jié)，芡糊制作和后期粉絲成型晾干都涉及短期回生，這與淀粉凝膠形成和凝膠軟硬度直接相關(guān)，進(jìn)而影響粉絲的品質(zhì)[9]。譚洪卓等[5]研究了不同添加劑對甘薯粉絲回生的影響，其中明礬對于甘薯淀粉糊的保持強(qiáng)度、最終黏度和回生值的影響最為明顯，但其指標(biāo)仍未超過綠豆淀粉。綠豆粉絲中含有35%以上的直鏈淀粉，使其凝膠強(qiáng)度大，粉絲韌性高，且回生產(chǎn)生的緊密結(jié)構(gòu)也使綠豆淀粉不易糊湯，因此綠豆粉絲的質(zhì)量普遍好過紅薯粉絲和馬鈴薯粉絲[10-11]。可見，提高淀粉中直鏈淀粉含量是提高粉絲質(zhì)量的有效手段。普魯蘭酶的作用只是增加淀粉中直鏈淀粉的含量，而酶只是一種蛋白質(zhì)，加熱變性后與普通的蛋白質(zhì)并沒有實質(zhì)性的區(qū)別。直鏈淀粉和蛋白質(zhì)都是薯類淀粉的正常成分，因此從食品安全的角度考慮，普魯蘭酶是一種理想的明礬替代物。本文作者前期建立的以普魯蘭酶替代明礬的粉絲制作方法存在缺陷是其普魯蘭酶的用量比較大，關(guān)鍵原因是目前市售普魯蘭酶都是針對淀粉制糖工藝開發(fā)的酸性普魯蘭酶，而粉絲的芡糊為中性，因此酶的活性難以充分發(fā)揮。來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)的普魯蘭酶基因GsP的表達(dá)產(chǎn)物為一種I型中性普魯蘭酶[12]，理論上更適合粉絲制作的工藝條件?？莶菅堪麠U菌(Bacillussubtilis)是一種公認(rèn)為食品安全(generally recogniczed as safe, GRAS)的微生物，以此為宿主生產(chǎn)的重組酶液更適合于粉絲制作，本文報道GsP基因在不同枯草芽孢桿菌宿主菌中的表達(dá)及其產(chǎn)物在粉絲制作中的應(yīng)用情況。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli)JM/09/pLac03-GsP[12]、B.subtilisWB600、1A717，均由本實驗室保藏；表達(dá)載體pUP43是一種大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭載體,為無錫先秦生物科技有限公司產(chǎn)品,該質(zhì)粒以P43啟動子控制外源基因的表達(dá),載體在芽孢桿菌中的復(fù)制原點及卡那霉素抗性均來源于芽孢桿菌載體pUB110。含有表達(dá)載體pUP43的大腸桿菌JM109/pUP43、本文構(gòu)建的B.subtillis1A717/pUP43-GsP和B.subtillisWB600/pUP43-GsP均已保藏在江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源數(shù)據(jù)平臺，保藏編號分別為：CICIM B6941、B6924和B6925。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶SpeI、SalI，賽默飛世爾科技有限公司；連接酶、蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒，北京博大泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、膠回收試劑盒，康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司；普魯蘭糖，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TB培養(yǎng)基，北京吉美生物科技有限公司；馬鈴薯淀粉(生粉、食品級)，寧夏固原成盛淀粉有限公司產(chǎn)品；食用鹽，淮牌食用鹽；其他試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 普魯蘭酶表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)GsP基因的序列，設(shè)計引物如下：

引物中帶下劃線部分為內(nèi)切酶識別位點，雙下劃線部分為核糖體結(jié)合位點。

以插入了嗜熱脂肪土芽孢桿菌普魯蘭酶基因GsP的重組質(zhì)粒pLac03-GsP[12]為模板，以Pgsp1、Pgsp2為引物PCR擴(kuò)增得到GsP基因片段。將擴(kuò)增得到的GsP片段純化后用SpeI和SalI酶切，與經(jīng)同樣酶切的表達(dá)載體pUP43載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后酶切驗證并測序。

1.4 表達(dá)普魯蘭酶重組菌株的構(gòu)建

使用Spizizen法[13]，將表達(dá)載體pUP43-GsP分別轉(zhuǎn)化菌株B.subtillis1A717和B.subtillisWB600，在含15 mg/L卡那霉素的LB平板上30 ℃培養(yǎng)檢出轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子劃線分離后提取質(zhì)粒。由于芽孢桿菌中提取的質(zhì)粒的酶切圖譜不夠清晰，將轉(zhuǎn)化子中提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從大腸桿菌中再次提取質(zhì)粒后酶切電泳驗證。以同樣的方法，將質(zhì)粒pUP43分別轉(zhuǎn)化菌株B.subtillis1A717和B.subtillisWB600構(gòu)建對照菌株?？莶菅挎邨U菌中提取質(zhì)粒的方法同文獻(xiàn)[14]。

1.5 重組菌普魯蘭酶的表達(dá)與檢測

取重組菌株B.subtillis1A717/pUP43-GsP、B.subtillisWB600/pUP43-GsP及對照菌株單菌落接種于20 mL含有15 mg/L卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h后，接種于50 mL 的TB培養(yǎng)基中37 ℃、200 r/min搖瓶發(fā)酵，接種量為2%。每隔8 h取一次樣，檢測OD600后離心取上清液檢測酶活。所有試驗均做5個平行樣。SDS-PAGE凝膠電泳檢測方法與普魯蘭酶酶活測定方法同文獻(xiàn)[15]。

1.6 粉絲制作工藝

稱取50 g馬鈴薯淀粉，加入50 mL、55 ℃的水將其制成懸液，再加入350 mL沸水制成芡糊。加入2 g食鹽和450 g生馬鈴薯淀粉和面，成團(tuán)后取出，裹上保鮮膜放置10 min，在粉絲機(jī)中壓成絲。粉絲機(jī)壓出的絲直接進(jìn)入水已經(jīng)沸騰的煮絲鍋中煮絲約1 min后，撈出用冷水冷卻，理絲晾干。其中明礬粉絲是在淀粉水懸液制成后加入相當(dāng)于粉絲淀粉總質(zhì)量0.1%的 明礬，待明礬充分溶解后進(jìn)入后續(xù)步驟。添加普魯蘭酶的粉絲是在芡糊制成后在芡糊中加入一定量酶液，在50 ℃保溫30 min。HN-2006粉絲機(jī)購自永康市博寧工貿(mào)有限公司。

1.7 斷條率、膨潤度和煮沸損失率計算方法

截取100 根長20 cm無損傷的成品粉絲，放在3 L去離子水中煮沸20 min。根據(jù)公式(1)計算粉絲斷條率。

(1)

式中：煮后粉絲條數(shù)是指煮后依然保持全長的粉絲的條數(shù)。

截取長度5 cm自然晾干的粉絲若干，在60 ℃烘箱中烘干至恒重，稱取約5 g為初始質(zhì)量m1(g)。將上述粉絲放入盛有200 mL沸騰去離子水的燒杯中，煮沸20 min，過程中不斷加水保持水量不變。煮好后將燒杯在冰水中冷卻，取出粉絲，用濾紙吸取表面水分，稱取含水粉絲的質(zhì)量m2(g)，再將含水粉絲置于60 ℃烘箱中烘干至恒重m3(g)，膨潤度和蒸煮損失率如公式(2)、(3)。

(2)

(3)

上述試驗均做2個平行樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體pUP43-GsP的構(gòu)建

以含有GsP基因的重組質(zhì)粒pLac03-GsP為模板，以Pgsp1、Pgsp2為引物PCR擴(kuò)增獲得2.2 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物大小與GsP基因一致。擴(kuò)增片段與表達(dá)載體pUP43連接獲得重組質(zhì)粒。由圖1-a中泳道1可見，重組質(zhì)粒用SpeI、SalI酶切獲得2.2 kb和6.7 kb 的2個片段，片段大小分別與GsP基因和載體pUP43一致，符合重組質(zhì)粒pUP43-GsP應(yīng)有特點(圖1-b)。

a-酶切驗證電泳圖譜；b-物理圖譜M-marker; 1-pUP43-GsP/Spe I+Sal I圖1 質(zhì)粒pUP43-GsP酶切驗證電泳圖譜和物理圖譜Fig.1 The restriction analysis of pUP43-GsP and map of the plasmid pUP43-GsP

2.2 GsP基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pUP43-GsP和空質(zhì)粒pUP43分別轉(zhuǎn)化B.subtillis1A717和B.subtillisWB600，在卡那霉素平板上檢出轉(zhuǎn)化子。4種轉(zhuǎn)化子各取一個菌落劃線分離后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后再進(jìn)一步提取質(zhì)粒驗證，結(jié)果顯示,從2種重組枯草芽孢桿菌中得到的質(zhì)粒的酶切圖譜與圖1完全一致，測序結(jié)果也顯示質(zhì)粒中插入片段的序列與GsP完全一致。將上述重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子分別命名為B.subtillis1A717/pUP43-GsP、B.subtillisWB600/pUP43-GsP，分別簡稱為1A717/pUP43-GsP和WB600/pUP43-GsP。空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子命名為B.subtillis1A717/pUP43、B.subtillisWB600/pUP43，分別簡稱為1A717/pUP43和WB600/pUP43。將此4株重組菌在TB培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵，間隔12 h分別取發(fā)酵上清液和細(xì)胞破碎液檢測酶活。結(jié)果顯示，含重組質(zhì)粒的重組菌1A717/pUP43-GsP和WB600/pUP43-GsP的發(fā)酵液有明顯的普魯蘭酶酶活，發(fā)酵至36 h時酶活分別達(dá)到74和55 U/mL。含空質(zhì)粒的2個重組菌上清液在標(biāo)準(zhǔn)條件下均未檢測到酶活，但當(dāng)檢測溫度下降至30 ℃時可以檢測到微弱的酶活，這可能是枯草芽孢桿菌自身普魯蘭酶基因的表達(dá)產(chǎn)物。上述4株菌的細(xì)胞破碎液均未檢測到普魯蘭酶酶活，可見GsP是一種胞外蛋白。發(fā)酵上清液的SDS-PAGE分析結(jié)果如圖2。

M-marker; 1-1A717/pUP43-GsP發(fā)酵液上清; 2-WB600/pUP43-GsP發(fā)酵液上清; 3-1A717/pUP43發(fā)酵液上清; 4-WB600/pUP43發(fā)酵液上清圖2 重組菌胞外蛋白SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of extracellular protein of different recombinants

相比含空質(zhì)粒的對照菌株，1A717/pUP43-GsP和WB600/pUP43-GsP發(fā)酵上清均含有一明顯的差異表達(dá)條帶，大小約為81 kDa，這一條帶與GsP蛋白的理論分子質(zhì)量一致，也與大腸桿菌JM109/pLac03-GsP表達(dá)的普魯蘭酶GsP一致[12]，這進(jìn)一步證明兩株重組菌均成功表達(dá)了GsP蛋白。進(jìn)一步將上述4株重組菌的細(xì)胞破碎液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，含重組質(zhì)粒的重組菌和含空質(zhì)粒的對照菌的蛋白條帶沒有明顯差異，這進(jìn)一步證明在枯草芽孢桿菌中，GsP基因的表達(dá)產(chǎn)物可以全部分泌到細(xì)胞外。將1A717/pUP-GsP和WB600/pUP43-GsP的發(fā)酵上清液進(jìn)行蛋白純化。用純酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，結(jié)果顯示，兩種枯草芽孢桿菌表達(dá)的重組GsP的酶學(xué)性質(zhì)與前文報道的大腸桿菌表達(dá)的GsP[12]完全一致，對此本文不再贅述。將純酶送上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行蛋白質(zhì)N-端分析，結(jié)果顯示，酶的N-端前6個氨基酸序列為Met-Leu-His-Ile-Ser-Arg，該序列與根據(jù)GsP基因序列推測的蛋白序列一致[12]。

2.3 GsP在兩種枯草芽孢桿菌宿主中的表達(dá)

重組菌1A717/pUP43-GsP和WB600/pUP43-GsP在TB培養(yǎng)基中的生長及產(chǎn)酶情況如圖3、圖4所示。

圖3 重組菌在TB培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.3 Cell growth curves of the recombinant strains in TB medium

圖4 重組菌株發(fā)酵上清液酶活增長曲線Fig.4 Extracellular enzyme activity growth curves of the recombinant strains

由圖3可見，1A717/pUP43-GsP生長速度明顯高于WB600/pUP43-GsP，最終達(dá)到的細(xì)胞密度也是前者大于后者，這可能與WB600蛋白酶基因缺失有關(guān)[16]。

由圖4可見，1A717/pUP43-GsP前期產(chǎn)酶速度明顯高于WB600/pUP43-GsP，這與前者細(xì)胞生長快是一致的。在48 h后，1A717/pUP43-GsP的酶活迅速下降，這可能源于枯草芽孢桿菌蛋白酶對外源蛋白的降解。WB600/pUP43-GsP的前期酶活增長較慢，但酶活增長一直持續(xù)到64 h，然后才開始緩慢下降。WB600/pUP43-GsP發(fā)酵酶活最高為126 U/mL，比1A717/pUP43-GsP的最高酶活(91 U/mL)高出38%，可見WB600更有利于GsP酶活的積累，這與前人的研究結(jié)果是一致的[17]。進(jìn)一步將兩種重組菌發(fā)酵獲得的上清液4 ℃保存，檢測2種酶液的保存穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，1A717/pUP43-GsP上清液的酶活半衰期不到2 d，而WB600/pUP43-GsP上清液的酶活半衰期大約為36 d。WB600/pUP43-GsP發(fā)酵產(chǎn)生的酶液的保存穩(wěn)定性顯著高于1A717/pUP43-GsP的酶液，可見枯草芽孢桿菌胞外蛋白酶對GsP有很強(qiáng)的降解，缺失蛋白酶基因的WB600菌株是更適合用于GsP表達(dá)的宿主菌。

2.4 兩種GsP對馬鈴薯粉絲質(zhì)量的影響

將2種普魯蘭酶發(fā)酵液用超濾設(shè)備濃縮，其中1A717/pUP43-GsP發(fā)酵液最終酶活為1 121 U/mL，WB600/pUP43-GsP最終酶活為1 252 U/mL。上述兩種普魯蘭酶分別簡稱為GsP1a和GsPwb，用于粉絲制作實驗。

在傳統(tǒng)粉絲的制作工藝基礎(chǔ)上，在芡糊制作完成后，加入普魯蘭酶酶液在50 ℃水浴反應(yīng)30 min，其他步驟不變。實驗結(jié)果如表1、表2所示。

表1 GsP1a不同添加量對馬鈴薯粉絲質(zhì)量的影響Table1 Effects of GsP1a on the vermicelli quality of potato flour

注：煮絲情況是指粉絲制作過程中的煮絲階段的情況，其中嚴(yán)重并條是指粉絲條在沸水中互相黏連并條，并條的粉絲在隨后的理絲階段無法手工分開，或分開后形成大量表面損傷，最終無法得到合格的粉絲；部分并條是指并條的粉絲在10%以內(nèi)，并可以在理絲階段手工分開；少量并條是指煮絲時并條粉絲一般在2%以內(nèi)。

表2 GsPwb不同添加量對馬鈴薯粉絲質(zhì)量的影響Table 2 Effects of GsPwb on the vermicelli quality of potato flour

由表1、表2可知，在不添加明礬或其他添加劑的條件下，以土豆淀粉為原料按傳統(tǒng)工藝制作粉絲時，在煮絲階段，粉絲之間會發(fā)生嚴(yán)重的并條，無法獲得合格的粉絲。適量添加普魯蘭酶處理芡糊后，煮絲階段并條問題可以得到解決，但兩種普魯蘭酶的作用效果有明顯差異。按芡糊中1.5 U/g淀粉使用GsP1a使用普魯蘭酶后，并條問題基本消失，粉絲成品的斷條率也接近于0，增加酶的用量雖然并不能進(jìn)一步改進(jìn)工藝和成品質(zhì)量但也沒有明顯的負(fù)面影響。使用GsPwb的情況則不同，按1.5 U使用GsPwb后，并條問題基本消失，但成品粉絲仍有少量斷條現(xiàn)象。繼續(xù)增加GsPwb后，并條現(xiàn)象反而更嚴(yán)重而且成品斷條率上升。本文使用的2種枯草芽孢桿菌宿主菌1A717和WB600的一個重要差異是前者的淀粉酶基因被敲除而后者淀粉酶基因正常，由此重組酶GsPwb酶液中很可能混有宿主菌WB600產(chǎn)生的α-淀粉酶。為了驗證這一點，我們將10 g/L的可溶性淀粉分別與GsPwb和GsP1a反應(yīng)，結(jié)果顯示，前者在反應(yīng)大約15 min后反應(yīng)液與碘液的藍(lán)色反應(yīng)消失，而后者反應(yīng)液與碘液混合后始終為深藍(lán)色。從以上實驗結(jié)果看，GsPwb中含有一定量的α-淀粉酶，這可能會導(dǎo)致芡糊中的淀粉鏈過度降解從而使芡糊的凝聚力下降，因此GsPwb在粉絲制作中的應(yīng)用效果不如GsP1a。

3 討論

本文用枯草芽孢桿菌為宿主菌實現(xiàn)了GsP的高效表達(dá)，對酶活和蛋白的檢測結(jié)果均顯示，重組蛋白全部分泌到細(xì)胞外。一個有趣的現(xiàn)象是本文使用的表達(dá)載體pUP43并沒有信號肽編碼區(qū)，用信號肽分析軟件Signal對GsP氨基酸序列進(jìn)行分析也未發(fā)現(xiàn)明顯的Sec途徑或Tat途徑的信號肽。序列比對發(fā)現(xiàn)，GsP與枯草芽孢桿菌的普魯蘭酶[18](簡稱BsP)氨基酸序列有50%的同源性，很可能是同一類分子，而BsP的N端有兩個相鄰的精氨酸，為典型的Tat途徑信號肽。因此，GsP很可能是通過Tat途徑分泌到細(xì)胞外的。本文對2種宿主菌表達(dá)的重組GsP蛋白純化后進(jìn)行N端序列分析，結(jié)果顯示，重組酶的N端是以起始翻譯密碼子編碼的Met開始，并且包括其后共計6個氨基酸殘基的序列與按照基因序列推測的蛋白序列完全一致。這說明GsP在芽孢桿菌中一定不是通過Sec途徑分泌的，因為通過這一途徑分泌的蛋白在分泌過程中其N端信號肽是被切除的[19]，而通過Tat途徑分泌的蛋白則一般不存在N端信號肽切除的現(xiàn)象[20]。

本文用2種宿主菌B.subtillis1A717和B.subtillisWB600分別進(jìn)行了GsP的表達(dá)，結(jié)果顯示，兩種宿主菌均能實現(xiàn)GsP的高效分泌表達(dá)，以WB600為宿主的表達(dá)水平高于1A717，前者表達(dá)的重組酶的穩(wěn)定性也明顯高于后者。從一般意義上講，WB600是一種更適合于GsP表達(dá)的宿主菌，但應(yīng)用實驗卻獲得了完全相反的結(jié)果，粉絲制作過程中降低并條現(xiàn)象和降低粉絲成品斷條率方面，1A717表達(dá)的重組酶GsP1a的表現(xiàn)均明顯優(yōu)于GsPwb。綜合兩種芽孢桿菌表達(dá)GsP的情況和酶的應(yīng)用性進(jìn)行分析不難看出，如果能夠?qū).subtillisWB600菌株的淀粉酶基因敲除則有可能獲得一種既能實現(xiàn)GsP的高效分泌表達(dá)，重組酶酶液性能又能滿足粉絲制作要求的重組菌。

重組酶GsP1a用于粉絲制作時，其最適用量大約為每克芡糊淀粉中加入1.5 U。芡糊淀粉大約占粉絲淀粉總質(zhì)量的10%，即粉絲的每克總淀粉中使用的GsP只有0.15 U，按本文制備的GsP1a酶活1 121 U/mL計算，每克淀粉中酶液的用量為0.013%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，這個添加量遠(yuǎn)低于明礬或其他明礬替代物的添加量。如果進(jìn)一步考慮酶液中大部分成分為水，那么實際干物質(zhì)的添加量更小，因此從食品安全角度考慮，使用GsP1a處理芡糊是一種制作無明礬粉絲的理想方法。