副干酪乳桿菌的基因多樣性及其抗生素耐受性分析

李曉姝，殷瑞敏，毛丙永，崔樹茂，趙建新

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)是干酪乳桿菌組群中的一個(gè)物種，與干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在糖原利用、基因序列特征等方面較為相近[1-2]。副干酪乳桿菌分布較廣，主要存在于人體腸道[3]、口腔[4]、生殖道[5]等，也常出現(xiàn)在乳制品[6]和發(fā)酵食品[7-8]中。2010年，衛(wèi)生部辦公廳發(fā)布的《關(guān)于印發(fā)可用于食品的菌種名單的通知》(衛(wèi)辦監(jiān)督發(fā)〔2010〕 65號(hào))中包括副干酪乳桿菌。多項(xiàng)研究表明，副干酪乳桿菌具有抑制腸道病原菌增殖、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)和提高機(jī)體免疫等益生功效[9-11]，愈發(fā)成為人們研究的熱點(diǎn)。

近年來，關(guān)于副干酪乳桿菌的菌株水平差異和遺傳多樣性的研究越來越廣泛。STEFANOVIC等[12]發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌組群內(nèi)的菌株具有遺傳和代謝的多樣性，SMOKVINA等[13]采用比較基因組學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌的進(jìn)化不總是與生態(tài)位適應(yīng)相關(guān)，BAO等[14]采用多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)的方法分析了224株分離菌株和5株參考菌株，發(fā)現(xiàn)菌株遺傳進(jìn)化與地區(qū)或食物來源不相關(guān)。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，采用基因組學(xué)的方法研究細(xì)菌物種多樣性及遺傳進(jìn)化關(guān)系將成為研究重點(diǎn)，SUN等[15]收集了213株乳桿菌屬的模式菌株，綜合比較基因組學(xué)和功能基因組學(xué)的分析方法，揭示了菌株分化和功能基因隨菌株進(jìn)化的過程，拓展了乳桿菌的生物應(yīng)用潛力。

在益生菌的安全性評(píng)價(jià)過程中，耐藥性評(píng)估是菌株篩選的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。某些具有高耐受能力的菌株可在抗生素治療疾病時(shí)繼續(xù)發(fā)揮作用，但同樣也存在將抗生素抗性基因轉(zhuǎn)移至病原菌的風(fēng)險(xiǎn)[16]。因此，研究副干酪乳桿菌的抗生素抗性基因的分布及菌株的抗生素耐受性規(guī)律是非常有必要的。

本研究采用基因組學(xué)的方法研究了不同地區(qū)、不同來源的33株副干酪乳桿菌的基因組特征，分析其核心基因、遺傳進(jìn)化關(guān)系及抗生素抗性基因，同時(shí)通過耐受性實(shí)驗(yàn)表征了副干酪乳桿菌的抗生素耐受能力，并與其攜帶的抗性基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為副干酪乳桿菌的基因組學(xué)及生物學(xué)特性等研究提供了數(shù)據(jù)參考和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

33株副干酪乳桿菌，分離自中國重慶市和青海省的人或動(dòng)物的糞便及泡菜樣品，保藏于江南大學(xué)食品生物技術(shù)研究中心的菌種保藏中心。

1.2 主要試劑和儀器

LBS培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；IST培養(yǎng)基、環(huán)丙沙星、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、利福平、鏈霉素、氯霉素、紅霉素、阿莫西林和克林霉素，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；UV1800紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；Illumina HiSeq 2000測(cè)序儀，美國Illumina公司。

1.3 菌株活化及DNA的提取

將33株副干酪乳桿菌在MRS液體培養(yǎng)基上連續(xù)活化3代，37 ℃培養(yǎng)16 h，接種1 mL菌液至100 mL MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24 h，取菌液在8 000 r/min條件下離心5 min并收集菌體。采用細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取基因組DNA，操作步驟參考試劑盒說明書。DNA提取后進(jìn)行質(zhì)量鑒定，在濃度和純度達(dá)到測(cè)序要求后進(jìn)行測(cè)序。其中，DNA提取及質(zhì)控由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.4 基因組測(cè)序、組裝和基因預(yù)測(cè)

使用Illumina HiSeq 2000對(duì)33株副干酪乳桿菌進(jìn)行測(cè)序，得到基因組草圖[17]，測(cè)序部分由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。SOAPdenovo v2.0軟件用于從頭組裝[18]，用Gap Closer軟件填補(bǔ)重疊群之間的內(nèi)部空白，移除500 bp以下的讀長(zhǎng)部分，用GeneMark.HMM[19]軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)編碼的開放閱讀框(open reading frame,ORF)，在COG數(shù)據(jù)庫[20]和NCBI NR數(shù)據(jù)庫上通過BLASTP注釋ORF。

1.5 泛基因組和核心基因組曲線及韋恩圖的繪制

PGAP v1.2.1[21]軟件用于統(tǒng)計(jì)副干酪乳桿菌的泛基因組和核心基因組，所有基因被分配到核心基因組或非必需基因組集合中，然后基于核心基因和非必需基因的數(shù)量，通過Perl腳本繪制泛基因組曲線圖。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建

使用ORTHOMCL V2.0.9軟件對(duì)菌株基因組進(jìn)行直系同源預(yù)測(cè)，然后使用MAFFT v7.3[22]軟件比對(duì)直系同源基因，提取聚類結(jié)果，通過Perl腳本繪制韋恩圖。使用系統(tǒng)發(fā)育推論程序包(PHYLIP)(http://evolution.genetics.washington.edu/phtlip.html)[23]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，采用鄰接法[24]計(jì)算副干酪乳桿菌之間的進(jìn)化距離，并用于繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 基因功能注釋

為了獲得基因組中的所有抗生素抗性基因(AR)，使用已注釋序列通過本地比對(duì)工具(BLAST,basic local alignment search tool)(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov)來查詢綜合抗生素抗性數(shù)據(jù)庫(com-prehencive antibiotic research database,CARD1.0.6，https：//arpcard.mcmaster.ca)[25]，若基因在CARD中的序列匹配度達(dá)到氨基酸序列同一性閾值的20%，則該基因?qū)⒈徽J(rèn)為是推定的AR決定簇。

1.8 抗生素耐受能力測(cè)定

參照歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)(European Committeeon Antimicrobial Suseeptibility Testing, EUCAST，http:∥www.eucast.org)、臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(CLSI; www.clsi.org)和ISO標(biāo)準(zhǔn)ISO10932—2010[26]，測(cè)定12種抗生素對(duì)副干酪乳桿菌的最低抑菌濃度(minimam inhibitory conceutration,MIC)，抗生素包括環(huán)丙沙星、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、利福平、鏈霉素、氯霉素、紅霉素、阿莫西林和克林霉素。

MIC值的測(cè)定在乳酸菌敏感性試驗(yàn)培養(yǎng)基(lactobacillus susceptibility MRS,LSM)中進(jìn)行。參照ISO10932-2010 (IDF223：2010)文件，LSM培養(yǎng)基由IST和MRS培養(yǎng)基按體積比9∶1混合制成。采用二倍數(shù)稀釋法，選擇相應(yīng)的溶劑配置不同濃度抗生素稀釋液(表1)；在無菌的96孔聚苯乙烯板中，每行第1孔加200 μL培養(yǎng)基為空白對(duì)照，第2孔～第11孔加抗生素稀釋液(濃度由低到高)，第12孔不加LSM培養(yǎng)基(不含抗生素)作為生長(zhǎng)對(duì)照，每孔100 μL。將菌株培養(yǎng)至穩(wěn)定期，測(cè)菌液吸光度OD625，根據(jù)OD625值預(yù)估菌液的稀釋比例，使得稀釋后的菌液濃度在105～106CFU/mL(OD625=1的參考濃度為3×108CFU/mL)。將稀釋的菌懸液在第2孔～第12孔中加100 μL，密封后置于厭氧工作站中37 ℃培養(yǎng)，48 h后取出用酶標(biāo)儀測(cè)定OD625。比較不同濃度下的OD625，菌株不出現(xiàn)生長(zhǎng)的抗生素濃度即為該抗生素對(duì)菌株的MIC值。同一抗生素濃度，做平行3個(gè)孔；做2次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，最終確定抗生素對(duì)菌株的MIC值。

表1 不同抗生素的稀釋濃度設(shè)置Table 1 Dilution concentration setting for different antibiotics

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株信息和基因組序列概況

本研究共有33株副干酪乳桿菌，其中12株分離自中國重慶泡菜樣品，10株分離自中國重慶糞便樣品，11株分離自中國青海糞便樣品。在21份糞便樣品中，1份來自動(dòng)物糞便，10份分離自藏族人群，10份分離自漢族人群，年齡在8～84歲。所有菌株的基因組大小在2.64 ～3.18 Mb，鳥漂呤和胞嘧啶比率(Guanine & Cytosine,GC)含量為46.04%～46.51%，詳見表2。

表2 33株副干酪乳桿菌的分離源信息及基因組概況Table 2 Information of isolation source and genomes of 33 Lactobacillus paracasei

2.2 泛基因組和核心基因組分析

在微生物領(lǐng)域，一個(gè)物種的全部基因被定義為泛基因組，包括核心基因組和非必需基因組。即使親緣關(guān)系較為密切的菌種，其泛基因組也可能存在較大差異[27-28]。33株副干酪乳桿菌泛基因組曲線如圖1所示，泛基因組的大小，在前13株菌的基因組中平均每株菌增長(zhǎng)247個(gè)基因，余下20株菌中平均每株菌增長(zhǎng)107個(gè)基因，最終大小為8 101個(gè)基因。泛基因組曲線呈現(xiàn)整體上升趨勢(shì)，表明該泛基因組暫時(shí)是開放型的，原因可能是副干酪乳桿菌分布廣泛，與外界各種遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換。

核心基因組是某個(gè)物種所有菌株保守的直系同源基因[13]，與物種的生物學(xué)功能和主要表型特征相關(guān)，反映該物種的穩(wěn)定性。由圖1可知，副干酪乳桿菌基因組的核心基因曲線呈現(xiàn)迅速下滑趨勢(shì)，并趨于平穩(wěn)，在第33個(gè)基因組加入后穩(wěn)定在1 945個(gè)基因，約占基因組的65%。王彥杰[29]發(fā)現(xiàn)78株糞腸球菌的核心基因組占總基因組的47.2%，相較之下，本研究中33株副干酪乳桿菌核心基因組所占比例較高，表明其基因多樣性較低，可能與分離地區(qū)和來源較少有關(guān)。

圖1 33株副干酪乳桿菌的泛基因組和核心基因組曲線Fig.1 Pan-genome and core genomes of 33 Lactobacillus paracasei

綜上，副干酪乳桿菌的泛基因組暫時(shí)是開放型的，通過更多副干酪乳桿菌的全基因組的加入，或者更多基因組序列通過更準(zhǔn)確的方式完全組裝，副干酪乳桿菌基因組的數(shù)據(jù)集將會(huì)不斷擴(kuò)充，最終獲得泛基因組的整體視圖，其可能因?yàn)榛蚪M多樣性有限最終達(dá)到閉合，亦有可能由于進(jìn)化方向多變或自身基因組多樣而一直呈現(xiàn)為開放式。副干酪乳桿菌的核心基因組為閉合曲線，說明物種穩(wěn)定性較高。

為評(píng)估33株副干酪乳桿菌的多樣性，本研究基于基因組聚類結(jié)果分析其核心基因組群，并繪制韋恩圖(圖2)，直系同源基因的個(gè)數(shù)顯示在圖中心，各菌株的特異性基因數(shù)量呈現(xiàn)在韋恩圖的花瓣外側(cè)，各菌株的總基因數(shù)標(biāo)注在名稱下方。33株副干酪乳桿菌中，直系同源基因數(shù)為1 945個(gè)；平均總基因數(shù)為2 988個(gè)， 其中FQHXN23L6的基因數(shù)最少(2 734個(gè))，VCQWX3_103L7的基因個(gè)數(shù)最多(3 217個(gè))；各菌株的特有基因數(shù)為10～141個(gè)。

圖2 33株副干酪乳桿菌的核心基因和特有基因分布Fig.2 Distribution of core genes of 33 Lactobacillus paracasei

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)化分析

為推斷33株副干酪乳桿菌的親緣關(guān)系及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化史，本研究基于直系同源基因構(gòu)建了一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖3)。

圖3 33株副干酪乳桿菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogeny tree of 33 Lactobacillus paracasei

進(jìn)化樹被分成4個(gè)大分支，其中A分支包含11株來自青海糞便樣品的菌株，其余B、C、D 3個(gè)分支包含22株來自重慶樣品的菌株，表明地域差異對(duì)副干酪乳桿菌的遺傳進(jìn)化具有重要影響。在B、C、D3分支下，共有5個(gè)次級(jí)分支，其中2個(gè)次級(jí)分支中菌株均來自糞便樣品，另外有2個(gè)次級(jí)分支中菌株均來自泡菜樣品，表明不同分離宿主來源對(duì)菌株基因組進(jìn)化有一定的影響。不同民族、年齡段樣本的菌株在進(jìn)化分支上分布規(guī)律不明顯，需要增加樣本數(shù)量以便探究影響副干酪乳桿菌遺傳進(jìn)化多樣性的因素。王彥杰及BONACINA等[29-30]均提出分離源并不是影響細(xì)菌基因組進(jìn)化的主要原因，這一結(jié)論與本文基本一致。綜上，在副干酪乳桿菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化方面，地域因素顯示出較高影響，其次是宿主分離源。

2.4 抗生素抗性基因分析

基于耐藥基因庫CARD對(duì)33株副干酪乳桿菌的基因組進(jìn)行比對(duì)，共發(fā)現(xiàn)60種抗生素抗性基因，其中有46種抗性基因存在于所有菌株中。統(tǒng)計(jì)各菌株中抗生素抗性基因的個(gè)數(shù)并繪制熱圖(圖4)，平均每株菌攜帶121個(gè)編碼基因，不同菌株攜帶的抗性基因數(shù)沒有明顯差異。在分離來源、地域等因素方面，抗性基因的豐度和分布沒有明顯聚類，表明菌株攜帶抗生素抗性基因數(shù)目與來源無關(guān)。

所有菌株均攜帶的46種抗性基因，與紅霉素、環(huán)丙沙星、氨基糖苷類、利福平等抗生素耐受相關(guān)，其中紅霉素抗性基因macB豐度最高；8株分離自青海省人源糞便樣本的副干酪乳桿菌不攜帶氯霉素抗性基因fexA；對(duì)于克林霉素抗性基因ErmB，只有FCQNA42L2和FCQNA38L1在這2株菌中存在，并且比對(duì)相似度達(dá)到98.8%；僅有FCQHC12L3這株菌攜帶四環(huán)素抗性基因tetM，序列相似度為90.1%。

2.5 抗生素耐受性測(cè)定

本研究測(cè)定了12種抗生素對(duì)33株菌的最小抑制濃度(MIC值)，結(jié)果如圖5所示?？股氐膮⒖紨帱c(diǎn)值參照標(biāo)準(zhǔn)的EFSA指南[30]以及歐洲委員會(huì)的動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)科學(xué)委員會(huì)(Scientific Committee on Aicmal Nutrition,SCAN)提出的建議，如果MIC值>斷點(diǎn)值，則認(rèn)為菌株對(duì)該抗生素具有抗性；如果MIC值≤斷點(diǎn)值，則認(rèn)為菌株對(duì)該抗生素敏感。

由圖5可知，氨基糖苷類抗生素(新霉素、卡那霉素、慶大霉素和鏈霉素)的MIC值普遍高于其他8種抗生素，這與SHAO等[31]的研究結(jié)果類似。對(duì)于新霉素、利福平、卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、慶大霉素和鏈霉素這7種抗生素，所有菌株都顯示敏感結(jié)果(圖5-A～圖5-L)，斷點(diǎn)值分析可知，阿莫西林、環(huán)丙沙星、紅霉素和四環(huán)素這4種抗生素，絕大多數(shù)菌株(32/33)都對(duì)其敏感(圖5-C～圖5-J)，這與DANIELSEN等[32]的研究結(jié)果一致，乳桿菌屬一般對(duì)能夠抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素較敏感。對(duì)于克林霉素，大多數(shù)菌株(31/33)表現(xiàn)出敏感性(圖5-B)。由此可見，副干酪乳桿菌對(duì)所研究的12種抗生素總體上都是敏感的，只有極少菌株會(huì)顯示出抗性。

圖4 33株副干酪乳桿菌攜帶抗性基因個(gè)數(shù)分布Fig.4 Antibiotic resistance(AR) gene counts of 33 Lactobacillus paracasei

從MIC值的分布趨勢(shì)來看，除克林霉素外，其余11種抗生素的MIC值均呈單峰分布，表明不同副干酪乳桿菌對(duì)抗生素耐受濃度相對(duì)較為集中。從MIC值跨越的濃度范圍來看，除氯霉素外，其余11種抗生素的MIC值跨度均較大，尤其克林霉素和四環(huán)素的MIC值范圍跨越了6個(gè)濃度，表明副干酪乳桿菌對(duì)這11種抗生素的耐受性存在一定差異。

為探究菌株耐藥性表型的差異與菌株分離來源之間的聯(lián)系，33株副干酪乳桿菌可分為重慶泡菜組、重慶糞便組和青海糞便組。由圖5可知，所有泡菜組菌株對(duì)12種抗生素都敏感，且泡菜組的MIC值范圍≤糞便組MIC值。尤其是卡那霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素和鏈霉素這4種抗生素，表明泡菜來源的菌株對(duì)抗生素具有更低的耐受性和更高的敏感性。33株副干酪乳桿菌中，只有部分菌株對(duì)克林霉素、阿莫西林、環(huán)丙沙星、紅霉素和四環(huán)素存在抗性，并且這些抗性菌株全部來自于糞便組。其中，只有菌株FCQNA42L2和FCQNA38L1對(duì)克林霉素表現(xiàn)出抗性，且為最高抗性(16 μg/mL)，此表型結(jié)果與前文基因結(jié)果吻合，只有這2株菌攜帶序列匹配度98.8%的編碼克林霉素抗性基因ErmB；只有菌株FCQHC12L3對(duì)四環(huán)素表現(xiàn)出抗性，且為最高抗性(64 μg/mL)，其攜帶匹配度極高的編碼四環(huán)素抗性的基因tetM。這3株菌的抗生素耐受表型與抗性基因關(guān)聯(lián)分析表明，抗生素抗性基因和表型存在一定的匹配性，表明基因組學(xué)研究對(duì)于表型特性分析有不可或缺的指導(dǎo)意義。糞便來源的副干酪乳桿菌對(duì)特定抗生素的抗性顯著高于泡菜來源的菌株，可能是抗生素的高頻使用導(dǎo)致了人或動(dòng)物樣本來源的菌株對(duì)抗生素具有較高的耐受性和抗性。

A-新霉素；B-克林霉素；C-阿莫西林；D-利福平;E-卡那霉素；F-氨芐青霉素;G-環(huán)丙水星；H-紅霉素；I-氨霉素；J-四環(huán)素；K-慶大霉素；L-鏈霉素圖5 33株副干酪乳桿菌對(duì)12種抗生素的MIC分布Fig.5 Distribution of MIC values for 12 antibiotics in 33 Lactobacillus paracasei注：垂直黑線代表參考斷點(diǎn)值。

3 結(jié)論

本研究采用比較基因組學(xué)的方法，對(duì)不同分離來源的33株副干酪乳桿菌的基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)泛基因組隨著更多細(xì)菌基因組的加入呈整體上升趨勢(shì)，核心基因組較為穩(wěn)定；分離源的地域因素對(duì)副干酪乳桿菌的遺傳進(jìn)化具有較為顯著的影響；所有菌株均攜帶46種抗生素抗性基因，不同菌株攜帶的抗性基因數(shù)沒有明顯差異。

對(duì)33株副干酪乳桿菌進(jìn)行抗生素的耐受性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其對(duì)12種抗生素總體上都是敏感的，但不同分離來源的菌株之間存在差異。從泡菜分離的菌株對(duì)抗生素具有低耐受性和高敏感性，部分從人糞便中分離的菌株對(duì)克林霉素、阿莫西林、環(huán)丙沙星、紅霉素和四環(huán)素具有抗性。

菌株FCQNA42L2和FCQNA38L1對(duì)克林霉素、FCQHC12L3對(duì)四環(huán)素均表現(xiàn)出最高抗性，可能與這些菌株攜帶克林霉素抗性基因ErmB和四環(huán)素抗性基因tetM有關(guān)。部分抗生素耐受表型結(jié)果與抗性基因分析結(jié)果一致，表明基因組學(xué)研究對(duì)于表型特性分析有重要的指導(dǎo)意義。