山羊乳蛋白質(zhì)及其組學(xué)分析

劉 翠蘆 晶張 維劉 鷺張書文安 穎*呂加平*

（1黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司 北京 100015

2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 北京 100193）

山羊乳含有200多種營(yíng)養(yǎng)素和活性物質(zhì)，其干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)等主要營(yíng)養(yǎng)成分含量均高于牛乳[1]。山羊乳蛋白質(zhì)顆粒細(xì)小，易于消化吸收，并且含有豐富的小分子活性蛋白，包括乳鐵蛋白、免疫球蛋白等，有利于提高人體免疫力[2-3]。中國(guó)古代醫(yī)學(xué)記載羊乳具有補(bǔ)腎、滋肺、健胃和利腸等滋補(bǔ)功效和美容養(yǎng)顏、抗炎、抗衰老等保健功效；而現(xiàn)代研究證實(shí)，山羊乳對(duì)肺病、腎病、肝病等有一定的治療和促進(jìn)健康作用[4]。FAO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，山羊乳年產(chǎn)量呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，2014年中國(guó)山羊乳產(chǎn)量315802t，較2013年增長(zhǎng)了6.7%，占世界山羊乳總產(chǎn)量的1.7%[5]。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以對(duì)乳中蛋白質(zhì)的含量以及組分進(jìn)行鑒定，也可對(duì)其翻譯后的修飾（如糖基化、磷酸化、乙?；龋┻M(jìn)行特征性描述[6]。基因本體位分析是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋的標(biāo)準(zhǔn)工具，在對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行功能注釋的基礎(chǔ)上提供蛋白質(zhì)功能的分布[7]。近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要應(yīng)用于對(duì)牛乳蛋白質(zhì)的研究中。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，牛乳中除所熟知的幾種主要蛋白質(zhì)外，還含有百余種具有不同生物活性的蛋白質(zhì)[8]，包括大量免疫蛋白、乳品成分合成相關(guān)的酶類及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞形態(tài)相關(guān)的蛋白質(zhì)等。Hettinga K等[9]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定出269種牛乳蛋白質(zhì)；Reinhardt T A等[10]鑒定出120種牛乳乳脂肪球膜蛋白質(zhì)。

關(guān)于山羊乳蛋白質(zhì)組學(xué)的研究相對(duì)較少，目前主要集中在乳脂肪球膜蛋白的分析上。Spertino S等[11]分析山羊乳脂肪球膜蛋白發(fā)現(xiàn)，其中主要蛋白為嗜乳脂蛋白、乳凝集素和脂滴包被蛋白。由于與牛乳相比，山羊乳屬于小眾乳品，因此人們對(duì)山羊乳的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如牛乳深入。然而，對(duì)山羊乳蛋白質(zhì)組學(xué)及其營(yíng)養(yǎng)特性研究的缺乏，阻礙了山羊乳作為高級(jí)乳制品的開(kāi)發(fā)。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)全面分析了山羊乳中乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白的種類及其功能分布，為山羊乳產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與設(shè)備

山羊乳和羊全脂乳粉，陜西關(guān)山隴州乳業(yè)有限責(zé)任公司；牛乳和牛全脂乳粉，黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司。山羊乳和牛乳均未經(jīng)高溫殺菌處理。

Prontosil 300-5-C18H，德國(guó)Bischoff公司；LTQ-Orbitrap XL，美國(guó)Thermo electron公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 毛細(xì)管電泳法 采用檸檬酸緩沖體系，對(duì)山羊乳中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白5種蛋白進(jìn)行分離和含量測(cè)定[12]。

1.2.2 山羊乳蛋白質(zhì)組學(xué)[13]

1.2.2.1 山羊乳蛋白的制備 將乳樣于1 500 g條件下離心10 min，分離得到脫脂乳和乳脂肪。在1 mL乳脂肪中加入10 mL去離子水，于1 500 g條件下離心10 min。重復(fù)洗脫3次。最終將洗脫的乳脂肪放于超聲波中持續(xù)超聲1 min，得到乳脂肪球膜蛋白。將脫脂乳于10 000 g條件下離心，得到乳清蛋白。

1.2.2.2 過(guò)濾器輔助樣品前處理方法 取10 μg蛋白樣品溶解于SDS-裂解液 【100 mmol/L Tris/HCl （pH 8.0）+4%SDS+0.1 mol/L 二硫蘇糖醇】。取 10 μL蛋白樣品加入 10 ku過(guò)濾器中，于20 000 g條件下離心30 min。在過(guò)濾器中加入100 μL 尿素溶液 （100 mmol/L Tris-HCl+8 mol/L尿素），20 000 g條件下離心 30 min。加入 100 μL 0.05 mol/L碘乙酰胺溶液在20 000 g條件下離心30 min。 分別加入 110，120 μL 和 130 μL 尿素溶液，在 20 000 g離心 30 min。 加入 140 μL 0.05 mol/L NH4HCO3，并于20 000 g條件下離心30 min。 加入 100 μL含有 0.5 μg胰蛋白酶的 0.05 mol/L NH4HCO3溶液，并將過(guò)濾器置于室溫過(guò)夜。最終將過(guò)濾器在20 000 g條件下離心30 min。用10%三氟乙酸調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)酶解液的pH值至2～4。此時(shí)，可以對(duì)樣品進(jìn)行納米流液相色譜測(cè)定（nanoLC-LTQ-Orbitrap-MS）。

1.2.2.3 NanoLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS將18 μL蛋白質(zhì)酶解液注入0.10 mm×32 mm Prontosil 300-5-C18H預(yù)濃縮柱，再?gòu)念A(yù)濃縮柱進(jìn)入分析柱 （0.10 mm×200 mm Prontosil 300-3-C18H），此時(shí)乙腈洗脫液（9%～34%乙腈于1 mL/L醋酸中）速度為0.5 μL/min。在預(yù)濃縮柱和分析柱之間有一個(gè)3.5 kV的電子噴霧器。記錄LTQ-Orbitrap XL中m/z在380～1 400之間的全掃描FTMS圖譜。MS/MS圖譜記錄FTMS中10個(gè)含量最高的帶兩個(gè)電荷和3個(gè)電荷的峰 （linear trap）。

1.2.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用Maxquant分析MS/MS圖譜。設(shè)定每個(gè)肽段有蛋氨酸的氧化或天冬氨酸或谷氨酰胺的脫酰胺反應(yīng)。將蛋氨酸的羧酰胺基甲基化設(shè)定為固定修飾（酶=胰蛋白酶，最多2處遺漏酶切點(diǎn)，肽段限值10 ppm，片段離子限值0.5 amu）。蛋白質(zhì)FASTA數(shù)據(jù)庫(kù)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載。最終，每個(gè)蛋白質(zhì)至少具有兩個(gè)測(cè)定出序列的肽段和1個(gè)特殊肽段，最低的sf值為1，蛋白質(zhì)的可能性值低于0.05。

1.2.2.5 生物信息學(xué)分析 基因本體位分析采用DAVID Bioinformatics Resources 6.7軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊乳中宏量蛋白質(zhì)分析結(jié)果

山羊乳中α-酪蛋白含量稍低于牛乳，有研究表明山羊乳中αs1-酪蛋白含量顯著低于牛乳[14]，而低αs1-酪蛋白含量的山羊乳可以減少抗原負(fù)擔(dān)，降低致敏性[15]。山羊乳相比于牛乳，不易造成過(guò)敏，可能與α-酪蛋白含量低有關(guān)。

山羊乳中β-酪蛋白含量為8.45 mg/mL，顯著高于牛乳（5.31 mg/mL）。有研究表明β-酪蛋白是最重要的肽前體，其中包括多種生物活性肽，如ACE抑制肽、阿片肽類、免疫活性肽和降血壓肽等[16]。Lee K J等[17]從羊乳酪蛋白水解物中分離出3種ACE抑制肽。Li Z等[18]研究表明山羊乳酪蛋白水解物具有非常強(qiáng)的抗氧化活性。

山羊乳中β-乳球蛋白的含量較高，為2.31 mg/mL，約是牛乳（1.4 mg/mL）的兩倍。Storry J E等[19]和Tay E P等[20]研究所得結(jié)果與本研究類似。β-乳球蛋白具有較強(qiáng)的結(jié)合脂溶性維生素和脂肪酸的能力，能促進(jìn)其在機(jī)體內(nèi)的吸收[21]。雖然牛乳中β-乳球蛋白與牛乳過(guò)敏有關(guān)[22]，但有研究發(fā)現(xiàn)，山羊乳β-乳球蛋白在牛乳過(guò)敏患者中被IgE識(shí)別的程度低，表明其結(jié)合IgE的能力較弱[23]，這不僅表明山羊乳β-乳球蛋白可能比牛乳β-乳球蛋白致敏性弱，也表明山羊乳可能不會(huì)在牛乳過(guò)敏者中產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。

2.2 山羊乳蛋白質(zhì)組學(xué)分析

2.2.1 山羊乳乳清蛋白質(zhì)組學(xué)分析

2.2.1.1 山羊乳乳清蛋白種類 本研究同時(shí)分析了山羊乳、羊全脂乳粉、牛乳、牛全脂乳粉。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)得到不同乳中的乳清蛋白種類。圖1顯示山羊乳和牛乳共有和各自特有的乳清蛋白數(shù)目以及不同乳樣中乳清蛋白的重疊情況。在山羊乳中共鑒定出103種乳清蛋白，牛乳中鑒定出86種乳清蛋白，山羊乳與牛乳共有蛋白種類為41種。在羊全脂乳粉中鑒定出69種乳清蛋白，在牛全脂粉中鑒定出64種乳清蛋白。

表1 不同乳源乳中蛋白質(zhì)含量（mg/mL）Table1 The protein content of different milk（mg/mL）

圖2為山羊乳和牛乳蛋白質(zhì)含量熱圖。方框1中為牛乳中特有或表達(dá)量較高蛋白質(zhì)，方框2中為牛乳與山羊乳中共有蛋白質(zhì)，方框3中為山羊乳中特有或含量相對(duì)較高的蛋白質(zhì)。

圖1 山羊乳與牛乳乳清蛋白Venn圖Fig.1 The venn diagram of whey protein in goat milk and bovine milk

圖2 山羊乳及牛乳乳清蛋白聚類分析熱圖Fig.2 The cluster analysis of whey protein in goat milk and bovine milk

2.2.1.2 山羊乳乳清蛋白功能分布 經(jīng)蛋白質(zhì)基因本體位分析（圖3）發(fā)現(xiàn)，山羊乳乳清蛋白中特有或含量相對(duì)較高的蛋白質(zhì)主要為參與蛋白質(zhì)酶解過(guò)程相關(guān)的蛋白，包括：參與調(diào)控蛋白質(zhì)酶解過(guò)程蛋白（23%）、急性炎癥應(yīng)激蛋白（17%）、參與調(diào)控細(xì)胞凋亡蛋白 （17%）、參與細(xì)胞轉(zhuǎn)移蛋白（14%）、激素刺激應(yīng)激蛋白（11%）、乙醇應(yīng)激蛋白（9%）、參與肌肉器官發(fā)育蛋白（9%）。牛乳乳清蛋白則主要是機(jī)體防御蛋白[24-25]。Hettinga K等[9]鑒定出269種牛乳蛋白質(zhì)中有51種機(jī)體防御蛋白，與本研究結(jié)果類似。由此可以得出，山羊乳與牛乳在乳清蛋白組成及功能上存在較大差異。

2.2.2 山羊乳乳脂肪球膜蛋白質(zhì)組學(xué)分析

2.2.2.1 山羊乳乳脂肪球膜蛋白質(zhì)種類 利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從山羊乳中鑒定出脂肪球膜蛋白121種，牛乳中361種，其中共有蛋白質(zhì)84種（圖4）。在羊全脂乳粉中鑒定出脂肪球膜蛋白49種，牛全脂乳粉61種。

如圖5所示，紅框1中為山羊乳中特有或含量較高的脂肪球膜蛋白，紅框2為牛乳中特有或含量較高的蛋白質(zhì)，紅框3為牛乳與山羊乳共有的蛋白質(zhì)。

圖3 山羊乳乳清特有蛋白質(zhì)基因本體位分析Fig.3 The gene ontology analysis of whey protein endemic to goat milk

圖4 山羊乳與牛乳乳脂肪球膜蛋白Venn圖Fig.4 The venn diagram of fat globule membrane protein in goat milk and bovine milk

2.2.2.2 山羊乳乳脂肪球膜蛋白功能分布 通過(guò)蛋白基因本體位分析發(fā)現(xiàn)，山羊乳中特有或含量較高的脂肪球膜蛋白主要參與蛋白質(zhì)翻譯及運(yùn)輸過(guò)程，功能分布（圖 6）：翻譯延伸（17%）、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)（14%）、細(xì)胞移動(dòng)（14%）、小G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)（11%）、細(xì)胞黏附（9%）、參與調(diào)節(jié)化學(xué)平衡蛋白（9%）、細(xì)胞成分形態(tài)（9%）、參與細(xì)胞凋亡蛋白（9%）、參與催化活性正調(diào)節(jié)蛋白（8%）。

牛乳乳脂肪球膜蛋白功能主要包括：蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)（23%）、信號(hào)傳導(dǎo)（23%）、未知（23%）、脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝（11%）、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)（9%）、蛋白質(zhì)合成或折疊（7%）、免疫蛋白（4%）、乳蛋白（2%）[10]。 由此可知山羊乳和牛乳在乳脂肪球膜的組成上存在差異，而乳脂肪球膜蛋白是乳中主要的功能蛋白。

圖5 山羊乳及牛乳乳脂肪球膜蛋白聚類分析熱圖Fig.5 The cluster analysis of fat globule membrane protein in goat milk and bovine milk

圖6 山羊乳中特有或含量高的乳脂肪球膜蛋白基因本體位分析Fig.6 The gene ontology analysis of the specific or high content of fat globule membrane protein in goat milk

2.3 乳粉加工工藝對(duì)山羊乳蛋白質(zhì)組學(xué)的影響

2.3.1 乳粉加工工藝對(duì)乳清蛋白的影響 乳粉加工工藝使山羊乳乳清中84%的蛋白質(zhì)含量下降（圖7紅框），原因可能是乳粉加工過(guò)程中乳清蛋白受熱變性，附聚于酪蛋白膠束上，從而使乳清中蛋白含量減少。乳清蛋白的高親水性，是乳粉熱加工過(guò)程率先變性的蛋白質(zhì)[26]。80%～91%的β-乳球蛋白和33%～45%的α-乳白蛋白會(huì)在熱處理過(guò)程中發(fā)生變性[27]。此外，熱處理導(dǎo)致的蛋白質(zhì)氧化變性有助于新型免疫活性結(jié)構(gòu)的形成，免疫活性增加[28]，這可能是因加熱導(dǎo)致乳蛋白復(fù)合物（包括酪蛋白、乳清蛋白和乳脂肪球膜蛋白）構(gòu)象重排而引起的[29]。

圖7 山羊乳及羊全脂乳粉乳清蛋白含量熱圖聚類分析Fig.7 The cluster analysis of whey protein in goat milk and milk powder

2.3.2 乳粉加工工藝對(duì)山羊乳乳脂肪球膜蛋白的影響 乳粉加工工藝使85%的山羊乳乳脂肪球膜蛋白含量降低，其中76種未在羊全脂乳粉中檢出（圖8）。而乳粉脂肪球膜蛋白質(zhì)中β-乳球蛋白、β-酪蛋白及α-酪蛋白的含量顯著增加，這可能是由于乳粉加工工藝中的均質(zhì)處理和熱處理過(guò)程，改變了乳脂肪球膜的結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)的組成與含量。有研究表明，乳脂肪球膜蛋白在均質(zhì)過(guò)程中增加，在熱處理過(guò)程中減少[30]。Ye A等[31]和Lee S J等[32]研究表明熱處理會(huì)引起乳清蛋白，如β-乳球蛋白和α-乳白蛋白等通過(guò)二硫鍵與乳脂肪球膜蛋白結(jié)合，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致乳脂肪球膜蛋白中的糖蛋白含量下降；而均質(zhì)處理會(huì)有引起酪蛋白與脂肪球膜蛋白結(jié)合。

圖8 山羊乳及羊全脂乳粉中脂肪球膜蛋白含量聚類分析熱圖Fig.8 The cluster analysis of fat globule membrane protein in goat milk and milk powder

通過(guò)對(duì)比山羊乳和羊全脂乳粉中乳清蛋白和脂肪球膜蛋白可知，乳粉加工過(guò)程中的熱處理等工藝在引起原料乳中蛋白質(zhì)含量下降的同時(shí)會(huì)通過(guò)各種相互作用產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)及其復(fù)合物，并同時(shí)賦予乳粉新的功能特性和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。目前關(guān)于山羊乳蛋白在乳粉加工中的變化鮮有報(bào)道，加工工藝對(duì)山羊乳理化性質(zhì)及生物功能的影響還待研究。

3 結(jié)論

通過(guò)測(cè)定山羊乳與牛乳中蛋白質(zhì)的組成及含量發(fā)現(xiàn)，山羊乳中 β-酪蛋白（8.45 mg/mL）和 β-乳球蛋白（2.31 mg/mL）含量顯著較高，α-酪蛋白含量稍低于牛乳。

通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了山羊乳和牛乳中乳清蛋白和乳脂肪球膜蛋白的組成及功能特性，結(jié)果：從山羊乳乳清蛋白中鑒定出103種，主要為參與蛋白質(zhì)酶解過(guò)程相關(guān)的蛋白；從牛乳乳清蛋白中鑒定出86種，主要是機(jī)體防御蛋白。從山羊乳乳脂肪球膜蛋白中鑒定出121種，主要參與蛋白質(zhì)翻譯及運(yùn)輸過(guò)程；從牛乳乳脂肪球膜蛋白中鑒定出361種，主要為參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白。

通過(guò)比較山羊乳與羊全脂乳粉蛋白質(zhì)組成差異發(fā)現(xiàn)，乳粉加工工藝會(huì)導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)的變性與結(jié)合反應(yīng)。山羊乳乳清中84%的蛋白質(zhì)含量下降，乳清蛋白是熱處理過(guò)程中首先變性的蛋白質(zhì)，尤其是β-乳球蛋白。乳粉加工工藝使85%的山羊乳乳脂肪球膜蛋白含量降低，熱處理和均質(zhì)過(guò)程在導(dǎo)致乳脂肪球膜蛋白含量降低的同時(shí)會(huì)引起其中的β-乳球蛋白、β-酪蛋白及α-酪蛋白的含量顯著增加。