果酒酵母菌多菌種混合培養(yǎng)的生長(zhǎng)規(guī)律及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異性分析

白夢(mèng)洋 吳祖芳 李若云 熊?chē)?guó)通 翁佩芳

（寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程系 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江寧波 315211）

果酒的風(fēng)味是衡量果酒品質(zhì)的最重要特征之一，其風(fēng)味成分十分豐富，由果酒酵母發(fā)酵形成的風(fēng)味物質(zhì)影響果酒的化學(xué)特性和感官特性[1]。果酒的香氣成分主要由兩類(lèi)組成，一類(lèi)是萜烯類(lèi)化合物，是由釀酒使用的原料品種及產(chǎn)地決定，而更多的風(fēng)味來(lái)源于二類(lèi)香氣物質(zhì)，主要包括醇類(lèi)、酯類(lèi)、酸類(lèi)、醛酮類(lèi)、脂肪酸、揮發(fā)性酚類(lèi)、含硫化合物、烴類(lèi)、羰基化合物及雜環(huán)類(lèi)化合物等，其種類(lèi)和產(chǎn)量與所用酵母密切相關(guān)[2-4]。果酒香氣的形成是一個(gè)復(fù)雜的內(nèi)部反應(yīng)，由多種揮發(fā)性化合物以及這些化合物之間通過(guò)各種方式相互作用，最終形成果酒的香氣和風(fēng)味[5]。

傳統(tǒng)果酒的發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的多種微生物共同作用的過(guò)程，酵母在其中起著重要的作用，是影響果酒風(fēng)味獨(dú)特性的最主要因素。與單菌種發(fā)酵相比，酵母的混合發(fā)酵能表現(xiàn)出更好的特性，如增加甘油含量和總酸度及產(chǎn)生多種酯類(lèi)、酮類(lèi)、揮發(fā)性酚類(lèi)等特殊物質(zhì)，改善果酒的質(zhì)量和品質(zhì)，增強(qiáng)果酒風(fēng)味多樣性[6-8]。在葡萄酒釀造過(guò)程中，釀酒酵母表現(xiàn)出很弱的β-葡萄糖苷酶活性，因此在發(fā)酵完成后大多數(shù)葡萄糖苷風(fēng)味前體物質(zhì)仍未被水解，而接種Debaryomyces vanriji后，能產(chǎn)生較高活力的β-葡萄糖苷酶，從而有效地釋放出風(fēng)味化合物[9]。Garcia等[10]研究發(fā)現(xiàn)，采用酵母菌聯(lián)合發(fā)酵72 h后，酶活力是對(duì)照葡萄酒中的2倍，且聯(lián)合培養(yǎng)發(fā)酵液中的幾種酸、醇、酯和萜烯醇的濃度明顯增強(qiáng)，使果酒的風(fēng)味得以增強(qiáng)和改善。

作者所在團(tuán)隊(duì)在前期研究中已篩選獲得對(duì)發(fā)酵風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)的畢氏酵母菌65（Pichia fabianii 65，簡(jiǎn)稱Pf）和東方伊薩酵母菌（Issatchenkia orientalis 166，簡(jiǎn)稱Io）以及酒精發(fā)酵的重要菌株——釀酒酵母菌131（Saccharomyces cerevisiae 131，簡(jiǎn)稱Sc），在細(xì)胞混合培養(yǎng)相互影響因素及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究基礎(chǔ)上（另文發(fā)表），進(jìn)行單菌種及混合培養(yǎng)，分析酵母菌混合發(fā)酵時(shí)生長(zhǎng)變化規(guī)律和揮發(fā)性風(fēng)味代謝產(chǎn)物。本研究結(jié)果可豐富果酒釀造混合菌發(fā)酵技術(shù)理論及探明風(fēng)味發(fā)酵形成的微生物作用機(jī)制，對(duì)改善果酒品質(zhì)和提高果酒釀造技術(shù)水平具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）131（簡(jiǎn)稱 Sc）、畢氏酵母菌（Pichia fabianii） 65（簡(jiǎn)稱Pf）、 東方伊薩酵母菌 （Issatchenkia orientalis）166（簡(jiǎn)稱Io）均保藏于寧波大學(xué)海洋學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基 （Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD）：葡萄糖 20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L（固體加入20 g/L瓊脂粉），pH 5.5±0.2。

含山梨醇的基本培養(yǎng)基 （minimal medium，MM）：5 g/L 蛋白胨、1 g/L 酵母浸粉、15 g/L 瓊脂、5 g/L山梨醇，pH 5.5±0.2。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；島津QP 2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；LDZX-40BⅠ型立式蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；XPX智能型生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；超聲波振蕩儀，昆山市淀山湖檢測(cè)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化 取甘油保藏菌種，劃線于YPD固體培養(yǎng)基上，于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取一環(huán)平板活化的菌體于50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，150 r/min恒溫培養(yǎng)24 h后于4℃冰箱中保藏備用。

1.3.2 發(fā)酵方法及生長(zhǎng)的測(cè)定 將活化好的酵母菌以同等比例混合接種于裝有50 mL滅菌YPD液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，并分別接種3種酵母菌作為純培養(yǎng)對(duì)照，30℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)?；旌吓囵B(yǎng)及純培養(yǎng)接種后培養(yǎng)液起始濃度均為2×105CFU/mL。

細(xì)胞數(shù)量測(cè)定采用平板計(jì)數(shù)法。在混合培養(yǎng)條件下，因釀酒酵母Sc和非釀酒酵母Pf生長(zhǎng)形態(tài)一致，肉眼難以區(qū)分，而Sc在含山梨醇的培養(yǎng)基上不能正常生長(zhǎng)，Pf可以正常生長(zhǎng)，故采用含山梨醇的基本培養(yǎng)基進(jìn)行選擇計(jì)數(shù)。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè) 固相微萃?。喝? mL發(fā)酵液樣品于15mL頂空樣品瓶中，將裝有PDMS萃取頭的SPME手動(dòng)進(jìn)樣器的針頭通過(guò)隔墊插入瓶中，推出纖維頭，于50℃ 恒溫吸附40 min，再移至20℃恒溫水浴鍋中平衡10 min，縮回纖維頭，并迅速將萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口進(jìn)行分析。

GC 條件：色譜柱為 Vocol1.8 μm×60 m×0.32 mm，0.32 mm；柱溫：起始溫度 35℃，保持 3 min，然后以3℃/min升至40℃，保持1 min，再以5℃/min升至210℃，保持16 min；載氣：氦氣；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣口溫度：210℃。

MS條件：電離方式為EI+，電子能量70 eV，接口溫度210℃，離子源溫度200℃，檢測(cè)器電壓0.8 kV；質(zhì)譜掃描范圍：30～650amu；檢索譜庫(kù)：WILEY和NIST譜庫(kù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)平行進(jìn)行3次，利用SAS 8.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Mev 4.9.0進(jìn)行熱圖歸納分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同混合培養(yǎng)條件下酵母菌的生長(zhǎng)變化

考察3種酵母菌純培養(yǎng)及不同混合培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，在發(fā)酵過(guò)程中，3種酵母菌均在12 h進(jìn)入穩(wěn)定期。純培養(yǎng)時(shí)，Pf和Sc均在24 h達(dá)到最大成長(zhǎng)量，分別為2.3×108CFU/mL和4.5×107CFU/mL，而Io在 20 h達(dá)到最大生長(zhǎng)量1.0×108CFU/mL。在3種酵母混合培養(yǎng)體系，酵母生長(zhǎng)量均未達(dá)到其純培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)量，這是由于混菌培養(yǎng)時(shí)三者相互競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)資源且相互抑制造成的[11]。非釀酒酵母Pf在競(jìng)爭(zhēng)中處于優(yōu)勢(shì)地位，最大生長(zhǎng)量為1.9×108CFU/mL，基本達(dá)到其純培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)量。Io生長(zhǎng)受到一定程度的抑制，為6.5×107CFU/mL。釀酒酵母Sc生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，僅為6.8×106CFU/mL。以上說(shuō)明在三者混合培養(yǎng)時(shí)，非釀酒酵母Pf生長(zhǎng)最為良好，而其它兩種酵母均受到不同程度的抑制。據(jù)研究報(bào)道，畢赤酵母能耐受低pH、低水分活度、高滲透壓、厭氧等極端環(huán)境，相比于釀酒酵母更能適應(yīng)外界環(huán)境脅迫[12]，且發(fā)酵過(guò)程中，非釀酒酵母產(chǎn)生的中長(zhǎng)鏈脂肪酸、寡聚肽、乳酸、環(huán)化高級(jí)醇等可能會(huì)抑制其它菌種的生長(zhǎng)[13]，因此在混合培養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)時(shí)處于優(yōu)勢(shì)地位。

圖1 不同混合培養(yǎng)方式的酵母菌生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic growth changes of yeasts by different culture

在兩兩混合培養(yǎng)體系中，非釀酒酵母均能良好生長(zhǎng)，生長(zhǎng)量和純培養(yǎng)時(shí)基本一致。在Sc和Pf混合體系中，Pf最大為 1.8×108CFU/mL，Sc 僅為6.4×106CFU/mL。 在 Sc和 Io混合時(shí)，Io最大為8.2×107CFU/mL，Sc 為 9.3×106CFU/mL。 可以看出，Pf對(duì)釀酒酵母Sc的抑制程度更高，一些研究證明非釀酒酵母在發(fā)酵初期會(huì)產(chǎn)生一些有毒化合物，類(lèi)似糖蛋白、多肽、小分子質(zhì)量的信號(hào)分子等會(huì)抑制釀酒酵母的生長(zhǎng)[14]。在后續(xù)試驗(yàn)中，非釀酒酵母生長(zhǎng)量不斷降低，逐漸被酒精耐受能力較高的釀酒酵母所取代，這可能是由于環(huán)境中酒精濃度升高，有機(jī)酸積累等導(dǎo)致的非釀酒酵母的衰亡[15]。

2.2 不同培養(yǎng)方式下?lián)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分分析

香氣作為果酒品質(zhì)最重要的特征之一，代表多種揮發(fā)性物質(zhì)的總和，混菌發(fā)酵能夠產(chǎn)生、增強(qiáng)一些有益風(fēng)味化合物如乙酸苯乙酯等，降解某些異味物質(zhì)如乙醛等，最終改變發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味特征[16]。對(duì)3種酵母分別純培養(yǎng)、兩兩混合培養(yǎng)及三者混合培養(yǎng)，取穩(wěn)定期發(fā)酵液，處理后用氣相色譜法分析揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分。將得到的色譜及質(zhì)譜圖與WILEY和NIST檢索譜庫(kù)分析比對(duì)，采用面積歸一化法計(jì)算各成分的相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)表1。作代謝熱圖分析見(jiàn)圖2。

表1 不同培養(yǎng)方式的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分分析Table1 Volatile flavor components by different culture methods

（續(xù)表1）

由表1、圖2可以看出，不同培養(yǎng)方式所產(chǎn)生的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)目及含量有所不同，共檢測(cè)出57種揮發(fā)性物質(zhì)成分，其中醇類(lèi)16種，醛類(lèi)5種，酯類(lèi)19種，酮類(lèi)7種，酸類(lèi)4種，其它成分6種。其中22種是共有的香味物質(zhì)，6種為釀酒酵母Sc所獨(dú)有，11種為非釀酒酵母Io所獨(dú)有，4種為非釀酒酵母Pf所獨(dú)有。

在兩兩混合培養(yǎng)體系中，Io與Sc混合培養(yǎng)和Io純培養(yǎng)體系揮發(fā)性物質(zhì)成分相似度較高，Pf與Sc混合培養(yǎng)和Pf純培養(yǎng)體系揮發(fā)性物質(zhì)成分相似度較高，推測(cè)可能是由于Io和Pf對(duì)Sc產(chǎn)生抑制，這與前期試驗(yàn)結(jié)果相符。在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)中，含量比例占最高的是醇類(lèi)和酯類(lèi)，分別檢測(cè)到16種和19種。其中釀酒酵母Sc所產(chǎn)生的醇類(lèi)最多，醇作為酵母代謝產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物[17]，達(dá)71.80%；非釀酒酵母Io為64.28%，Pf為43.61%，說(shuō)明釀酒酵母較非釀酒酵母代謝產(chǎn)生的醇類(lèi)物質(zhì)能力強(qiáng)，3種酵母產(chǎn)生醇類(lèi)含量最多的均為乙醇、異戊醇、2-甲基-1-丁醇和苯乙醇，苯乙醇具有花香，且具有一定的殺菌能力，會(huì)發(fā)出誘人且香甜的茉莉花香，有柔和愉悅的感受[18]。有研究表明，少量高級(jí)醇能賦予果酒特殊的香氣，同時(shí)也是其它香氣物質(zhì)的良好溶劑，它們的嗅覺(jué)閾值一般很低，香氣值較高，對(duì)風(fēng)味組成具有重要作用[19]。揮發(fā)性酯類(lèi)作為香氣化合物的重要組成，賦予果酒特殊的水果香氣，對(duì)果酒風(fēng)味貢獻(xiàn)最大，在酯類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)中，單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，非釀酒酵母Pf可產(chǎn)生大量的乙酸乙酯，占31.1%，有濃郁的菠蘿香氣[20]。Pf和Sc混合培養(yǎng)時(shí)，乙酸乙酯含量有所升高，占34.61%，乙酸異戊酯相對(duì)含量由7.42%升為10.04%，具有一定的香蕉香氣[21]。兩兩混合培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生的酯類(lèi)物質(zhì)整體上較純培養(yǎng)時(shí)多，可見(jiàn)混合發(fā)酵可豐富酒體的酯類(lèi)物質(zhì)風(fēng)味，例如產(chǎn)生具有清甜蘋(píng)果香氣的甲酸乙酯及杏仁香的乙酸苯甲酯等[22]。此外，混合培養(yǎng)時(shí)，酸類(lèi)和酮類(lèi)的也發(fā)生一些變化，其種類(lèi)和相對(duì)含量與單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)有所不同，酸類(lèi)和酮類(lèi)均為烷烴類(lèi)有機(jī)化合物氧化的最終產(chǎn)物，屬于果酒中典型的呈味物質(zhì)，特別是乙酰丙酮、呋喃酮對(duì)果酒風(fēng)味貢獻(xiàn)較高[23]。在醛類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)中，不同培養(yǎng)方式的乙醛都占有很高比例，其對(duì)香氣起著重要作用，同時(shí)，乙醛也是乙酸、乙偶姻合乙醇的合成前體，低含量的乙醛就能起到很好的媒介功能[24]。

圖2 不同培養(yǎng)方式的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)代謝熱圖Fig.2 H-Clustering-Heat Map of volatile flavor components by different culture methods

將3種酵母作混合培養(yǎng)處理時(shí)，可以看出醇類(lèi)相對(duì)含量有所下降，占41.32%，均低于單獨(dú)及兩兩培養(yǎng)時(shí)的醇類(lèi)含量，推測(cè)產(chǎn)醇類(lèi)的釀酒酵母可能受到明顯抑制。酯類(lèi)相對(duì)含量顯著增加，達(dá)56.34%，其中含量最高的是乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯和乙酸丙酯，分別為32.15%，11.72%，3.71%和2.68%，含量均高于純培養(yǎng)或兩兩混合培養(yǎng)，說(shuō)明3種酵母混合可大大增強(qiáng)果酒發(fā)酵的特殊風(fēng)味。此外，在培養(yǎng)過(guò)程中，也發(fā)現(xiàn)酚類(lèi)、吡嗪及含硫化合物，這些物質(zhì)的閾值很低，具有強(qiáng)烈的芬芳，例如甲基乙基吡嗪、3-甲酚等產(chǎn)生的泥土味、金屬味等特殊氣味共同構(gòu)成果酒發(fā)酵獨(dú)特的風(fēng)味[25]。

3 結(jié)論

比較釀酒酵母Sc和非釀酒酵母Pf、Io純培養(yǎng)及混合培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)差異，結(jié)果表明，兩兩混合培養(yǎng)時(shí)，非釀酒酵母均能良好生長(zhǎng)，生長(zhǎng)量和純培養(yǎng)基本一致，而釀酒酵母Sc受到不同程度的抑制，且Pf對(duì)釀酒酵母的抑制程度更高；三者混合培養(yǎng)時(shí)，由于相互競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)資源且相互抑制，所以3種酵母均未達(dá)到其純培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)量，非釀酒酵母Pf在競(jìng)爭(zhēng)中處于優(yōu)勢(shì)地位，Io生長(zhǎng)受到抑制，釀酒酵母Sc受抑制程度嚴(yán)重。

從不同混合方式發(fā)酵的菌種中共檢測(cè)到57種揮發(fā)性物質(zhì)成分，其中醇類(lèi)16種、醛類(lèi)5種、酯類(lèi)19種、酮類(lèi)7種、酸類(lèi)4種和其它6種，有22種是共有的香味物質(zhì)，6種為釀酒酵母Sc所獨(dú)有，11種為非釀酒酵母Io所獨(dú)有，4種為非釀酒酵母Pf所獨(dú)有。Io與Sc混合培養(yǎng)和Io純培養(yǎng)相比揮發(fā)性物質(zhì)成分相似度較高，Pf與Sc混合培養(yǎng)和Pf純培養(yǎng)相比揮發(fā)性物質(zhì)成分相似度較高，相對(duì)含量比例最高的是醇類(lèi)和酯類(lèi)，釀酒酵母Sc產(chǎn)生的醇類(lèi)最高達(dá)71.80%，非釀酒酵母Io為64.28%，Pf為43.61%。3種酵母產(chǎn)生醇類(lèi)含量最多的依次為乙醇、異戊醇、2-甲基-1-丁醇和苯乙醇，酯類(lèi)物質(zhì)中乙酸乙酯和乙酸異戊酯含量最高，提供果酒特殊風(fēng)味。3種酵母混合培養(yǎng)時(shí)醇類(lèi)相對(duì)含量有所下降，占41.32%，均低于單獨(dú)及兩菌混合培養(yǎng)時(shí)的醇類(lèi)含量，而酯類(lèi)相對(duì)含量顯著增加，達(dá)56.34%，其中含量最高的是乙酸乙酯（32.15%）、乙酸異戊酯（11.72%）、乙酸苯乙酯（3.71%）和乙酸丙酯（2.68%），均高于純培養(yǎng)或兩菌混合培養(yǎng)，說(shuō)明3種酵母菌混合培養(yǎng)可大大增強(qiáng)果酒發(fā)酵的特殊風(fēng)味。此外，也發(fā)現(xiàn)酚類(lèi)、吡嗪及含硫化合物共同構(gòu)成果酒發(fā)酵獨(dú)特的風(fēng)味。