單辛酸甘油酯對即食濕面中金黃色葡萄球菌的抑制模型

索 標 趙雅健 李 真 徐 超 潘治利 艾志錄 *

（1河南農業(yè)大學食品科學技術學院 國家速凍米面制品加工技術研發(fā)專業(yè)中心 鄭州 450002

2農業(yè)部大宗糧食加工重點實驗室 鄭州 450002

3速凍面米及調制食品河南省工程實驗室 鄭州 450002）

食濕面是在生鮮面基礎上，經煮制、配料包裝而成，因其簡單、營養(yǎng)、衛(wèi)生和快捷方便等優(yōu)點，具有廣闊的市場前景。然而，即食濕面在全加工鏈條中容易受到各種致病菌的污染，嚴重影響人們的食用安全。金黃色葡萄球菌作為引起細菌性食物中毒的重要病原菌之一，由于普遍存在于環(huán)境中，且生存能力極強[1]，因而對即食濕面加工、包裝及儲藏過程造成極大危害。為了有效抑制即食濕面中微生物的生長，加強其安全性，通常采用在即食濕面中添加抑菌劑的辦法，其簡單有效，具有廣闊的應用前景。單辛酸甘油酯對革蘭氏細菌、霉菌、酵母菌有很好的抑制作用，且熱穩(wěn)定性好[2]。目前國內外有關單辛酸甘油酯的研究不多。現(xiàn)有研究已證實，單辛酸甘油酯對金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌效果[3]。然而，有關單辛酸甘油酯對即食濕面中金黃色葡萄球菌的抑制作用還鮮有研究報道。

隨著食品安全日益受到重視，預測微生物學引起食品安全研究人員的普遍關注[4]。預測微生物學是運用微生物學、工程數(shù)學及統(tǒng)計學進行數(shù)學建模，利用所建模型預測描述特定食品環(huán)境下微生物的生長和死亡狀況[5]。因此，預測微生物學模型可用于食品生產和銷售的全產業(yè)鏈中，以科學評估不同的參數(shù)組合（時間、溫度以及抑菌劑濃度等）對致病菌消長及食品貨架期的影響規(guī)律，從而確保食品的品質安全[6]。美國農業(yè)部東部研究中心開發(fā)的微生物模型分析軟件IPMP，操作簡單方便，且對數(shù)據(jù)分析和模型開發(fā)的結果具有較高精確度[7]。到目前為止，基于IPMP軟件及其相關模型，LI C等[8]建立了鮭魚籽中單核細胞增生李斯特菌的生長動力學模型；WANG等[9]建立了經酸、低溫、饑餓處理的單核細胞增多性李斯特氏菌在含有β-酸和HBA即食火腿中的生長動力學模型。

本試驗以添加不同濃度的單辛酸甘油酯的即食濕面為對象，研究不同溫度下金黃色葡萄球菌的變化規(guī)律，并利用IPMP軟件進行模型擬合，為研究金黃色葡萄球菌在即食濕面中的定量風險評估，提高其食用安全性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌ATCC 6538，來源于美國菌種保存中心（ATCC）。

單辛酸甘油酯（食品級），河南亞統(tǒng)食品原料有限公司；Baird-Parker基礎培養(yǎng)基、無菌自封袋等，北京陸橋技術有限責任公司；其它試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設備

移液器，德國Eppendorf公司；SX-500高壓蒸汽滅菌鍋，日本Tomy公司；金凈潔凈工作臺，吳江市凈化設備總廠；LHP-250智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海鴻都電子科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 即食濕面的制備 即食濕面制作流程：面粉/水（質量比 5∶2）+不同質量分數(shù)（0，0.03%，0.06%和0.1%）的單辛酸甘油酯→和面→醒發(fā)→壓延→切條→水煮（至面條白芯消失）→水洗→稱量（10g）→包裝→備用。

1.3.2 人工污染金黃色葡萄球菌 用接種環(huán)挑取金黃色葡萄球菌單菌落至加有0.6%酵母浸粉的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSB-YE）中，在37℃，150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)后期（～108CFU/mL）[10]，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）10 倍梯度稀釋得到104CFU/mL的菌液。取0.1 mL人工污染10 g上述即食濕面樣品，使樣品中金黃色葡萄球菌人工污染量為102CFU/g。人工污染后的即食濕面經密封包裝后放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱，于10～35℃儲藏。定期取樣測定金黃色葡萄球菌的數(shù)量，每樣重復3次。

1.3.3 金黃色葡萄球菌計數(shù) 金黃色葡萄球菌活細胞計數(shù)前，向10 g即食濕面樣品的無菌袋內加入90 mL無菌鹽水，在均質器中拍打2 min，使之與樣品混合均勻。取上清液以10倍梯度稀釋，并取適當稀釋度于Baird-Parker基礎培養(yǎng)基上涂布平板，37℃下培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

1.4 建模方法

1.4.1 初級模型 初級模型描述的是特定環(huán)境條件下，微生物的繁殖數(shù)量與時間之間的關系。本試驗采用Huang、Baranyi和 Reparamerized Gompertz模型擬合金黃色葡萄球菌在即食濕面中的生長曲線，并比較這3種模型的SSE（誤差平方和）、MSE（均方差）、RMSE（均方根誤差）和 Residual Stdev（殘差方差）[11]。4個參數(shù)的值越接近于0，表明模型擬合度越好[12]。

Huang模型公式：

式中：t——時間（h）；Y0和Ymax——分別為初始和最大菌數(shù)（CFU/g）；Y（t）——在時間t時的菌數(shù)（CFU/g）；μmax——微生物生長的最大比生長速率（h-1）；λ——微生物生長的延滯時間（h）；遲滯期系數(shù) α=4。

Baranyi模型公式：

式中：t——時間（h）；Y0和Ymax——分別為初始和最大菌數(shù)（CFU/g）；Y（t）——在時間t時的菌數(shù)（CFU/g）；μmax——微生物生長的最大比生長速率（h-1）；λ——微生物生長的延滯時間（h）。

1.4.2 二級模型 二級模型表達的是關于初級模型參數(shù)與環(huán)境條件變量之間的函數(shù)關系。一般常用遲滯期和最大生長速率作為參數(shù)來研究微生物的生長狀況受不同環(huán)境條件的影響[13-14]。本試驗選用Origin 8.5軟件來建立金黃色葡萄球菌的生長遲滯期lnLT和最大比生長速率lnSGR關于溫度、抑菌劑濃度的Polynomial二級預測模型。Polynomial模型數(shù)學公式如下：

式中：lnLT——遲滯期對數(shù)；lnSGR——最大

式中：t——時間 （h）；Y0和Ymax——分別為初始和最大菌數(shù)（CFU/g）；Y（t）——在時間t時的菌數(shù)（CFU/g）；μmax——微生物生長的最大比生長速率（h-1）；λ——微生物生長的延滯時間（h）。比生長速率對數(shù)；a～l——常數(shù)；T——溫度 （℃）；C——抑菌劑質量分數(shù)（%）。

1.4.3 模型驗證 通過確定系數(shù)R2、均方誤差RMSE、準確因子Af和偏差因子Bf對lnLT和lnSGR的二級模型方程進行驗證[15-16]。確定系數(shù)R2用于判斷模型擬合的精確度，R2值在0～1之間，R2值越高，說明模型擬合度越高，模型擬合越精確；均方誤差RMSE值越接近0，表明模型擬合度越好[17]。準確因子Af越接近于1，表明模型的準確度越高；偏差因子Bf越接近于0，說明模型的偏差度越小[18]。二者表達式[19]如下：

式中：μpred——預測值；μobs——實測值；n——試驗次數(shù)。

2 結果與分析

2.1 初級模型

根據(jù)金黃色葡萄球菌的生長數(shù)據(jù)，采用Huang、Baranyi與 Reparamerized Gompertz模型分別描述其生長動態(tài)。其模型比較參數(shù)見表1。3種模型的 SSE、MSE、RMSE 和 Residual Stdev均較小且相差不大。在全部24組不同溫度和單辛酸甘油酯濃度組合所得數(shù)據(jù)中，3種組合的SSE、MSE、RMSE和Residual Stdev值在 Baranyi模型中最小，12種組合用Huang模型擬合時最小，剩余9組組合用Reparamerized Gompertz模型擬合的值最小。由于Huang模型擬合的參數(shù)最小的組數(shù)最多，因此本文選用Huang模型來描述金黃色葡萄球菌的生長趨勢[20]。

表1 即食濕面中金黃色葡萄球菌生長的3種預測模型參數(shù)Table1 Parameters of three kinds of models in predicting the growth of S.aureus in ready-to-eat noodles

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

由圖1 Huang模型曲線可知，不同溫度、濃度的單辛酸甘油酯對即食濕面中金黃色葡萄球菌的生長均有一定抑制作用，且隨單辛酸甘油酯濃度的增高，這種抑制作用增大。以正常金黃色葡萄球菌在即食濕面中的生長曲線為對照，在同一溫度，質量分數(shù)0.03%，0.06%，0.1%條件下均能降低金黃色葡萄球菌的生長速率，且均以質量分數(shù)0.1%的生長速率降低最快。如35℃時，金黃色葡萄球菌在未添加抑菌劑的即食面條中生長20 h，其數(shù)量可達 7.45 lg（CFU/g），而在抑菌劑質量分數(shù)0.03%，0.06%，0.1%時，金黃色葡萄球菌分別為7.33 lg（CFU/g），7.14 lg（CFU/g）和 7.03 lg（CFU/g）；抑菌劑濃度相同時，溫度越低，金黃色葡萄球菌的生長速率越小，如抑菌劑質量分數(shù)為0.06%時，金黃色葡萄球菌在20℃生長72 h的數(shù)量達到6.81 lg（CFU/g），而在 10℃的數(shù)量僅達到 3.50 lg（CFU/g）。

圖1 不同溫度下添加單辛酸甘油酯的即食濕面中金黃色葡萄球菌生長的Huang模型擬合曲線圖Fig.1 Growth curves of S.aureus in ready-to-eat noodles supplemented with different concentrations of CMG at different temperatures using Huang models

低溫時單辛酸甘油酯對金黃色葡萄球菌的抑制作用較高溫條件明顯。在一定范圍內，溫度越低，抑菌劑濃度越高，金黃色葡萄球菌的生長越緩慢，如10℃抑菌劑0.1%條件較之35℃未添加抑菌劑的條件，金黃色葡萄球菌的生長數(shù)量達到5.8 lg（CFU/g），所需時間分別為6 h和216 h。由此說明低溫和添加抑菌劑對金黃色葡萄球菌生長的抑制具有協(xié)同增效作用。在低溫條件下，大量具有活性的金黃色葡萄球菌細胞處于亞致死損傷狀態(tài)[21-22]，雖然大量細胞仍保留著相對完整的細胞膜和細胞壁結構，但當添加抑菌劑時，與常溫條件下的細胞相比，低溫條件下的細胞更容易遭受損傷而失活[23]。其原因可能是低溫與單辛酸甘油酯對金黃色葡萄球菌生長有協(xié)同抑制作用。

將 試驗所得 Y0、Ymax、μmax、λ 及遲 滯期系數(shù) α的值分別代入公式（1），即可得到即食濕面中金黃色葡萄球菌生長Huang模型方程，如表2所示。根據(jù)方程可分別計算在溫度10～35℃和0～0.1%抑菌劑范圍內金黃色葡萄球菌生長t時間時的數(shù)量。

表2 不同溫度下添加單辛酸甘油酯的即食濕面中金黃色葡萄球菌的Huang生長模型方程Table2 Huang model of the growth curves of S.aureus in ready-to-eat noodles supplementd with different concentrations of CMG at different temperatures

2.2 二級模型

將參數(shù)lnLT和lnSGR與溫度和濃度代入公式（4）、（5）得到二級模型，其方程分別為：

Polynomial模型擬合結果見圖2。溫度對參數(shù)遲滯期時間lnLT和最大生長速率lnSGR有明顯的影響，而抑菌劑濃度對參數(shù)lnLT和lnSGR也有一定的影響。隨著溫度的增加，參數(shù)lnLT與lnSGR也隨之降低和升高 （圖2a、2b），當溫度35℃時，lnLT最小，而lnSGR最大；溫度10℃時，反之。隨濃度的增加，參數(shù)lnLT與lnSGR有所升高和降低（圖2c、2d）。由此說明，隨溫度的增加和抑菌劑濃度的降低，金黃色葡萄球菌的遲滯期降低，最大生長速率升高，溫度和抑菌劑濃度對金黃色葡萄球菌的抑制作用加強，這與初級模型的結論一致。

圖2 參數(shù)lnLT和lnSGR與溫度和CMG濃度的二級模型擬合曲線Fig.2 Secondary model of the effect of the temperature and CMG concentration on the parameters lnLT and lnSGR

2.3 模型驗證

由表3 Polynomial模型擬合后的參數(shù)值可知，Polynomial模型中 lnLT和 lnSGR的 R2均在0.98以上 （分別為0.983和0.985），RMSE值都很小，接近于 0，準確因子 Af（分別為 0.950和0.988），均接近于 1；偏差因子 Bf（分別為 1.052 和1.012）在1.0～1.1之間，表明所建模型在可接受范圍內[24-25]，建立的生長模型準確因子較高，此模型能很好地說明lnLT和lnSGR與溫度、抑菌劑濃度之間的關系。由此得出Polynomial模型方程表達lnLT和lnSGR與溫度和抑菌劑濃度之間的關系是準確可靠的。

表3 二級模型的驗證結果Table3 Validations of the secondary models

3 結論

采用IPMP軟件中的Huang模型方程擬合不同溫度和單辛酸甘油酯濃度條件下即食濕面中金黃色葡萄球菌的生長狀況，得出Huang、Baranyi和Reparamerized Gompertz模型的相關參數(shù) SSE、MSE、RMSE和Residual Stdev的值均較小且相差不大。相比之下，Huang模型的4個參數(shù)值最小的組數(shù)最多，說明所建Huang模型可以很好地描述不同條件下金黃色葡萄球菌的生長情況。之后對10，15，20，25，30，35 ℃的生長參數(shù) lnLT、lnSGR 與溫度和單辛酸甘油酯的濃度進行二級擬合，結果準確因子Af較小，均接近于1；偏差因子Bf（1.0～1.1）接近于1，均在可接受范圍內。由此說明所建Polynomial二級模型能很好地表達lnLT和lnSGR分別與溫度和濃度之間的函數(shù)關系。

Huang模型可作為預測不同溫度與濃度條件下即食濕面中金黃色葡萄球菌的生長狀況的依據(jù)，這為通過單辛酸甘油酯（CMG）結合溫度來抑制食源性致病菌金黃色葡萄球菌在方便食品中的生長，提供了理論依據(jù)。