丙戊酸對乳腺癌MCF7細(xì)胞的放射增敏性依賴于抑癌基因p53

田竹筠，楊春旺，蔡祖超，鳳志慧

（1.山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，山東濟(jì)南250012；2.濟(jì)南市第三人民醫(yī)院，山東濟(jì)南250132）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，我國乳腺癌發(fā)病率和死亡率雖均低于世界平均水平，但近年來乳腺癌的發(fā)病率呈迅速增長趨勢，因此，如何有效治療乳腺癌備受關(guān)注。電離輻射（ionizing radiation，IR），即放射治療是臨床上常用的乳腺癌治療手段，尋找有效地增強(qiáng)放射治療效果的增敏劑是該領(lǐng)域研究的焦點問題。IR 能導(dǎo)致嚴(yán)重的DNA 損傷，即誘發(fā)DNA 雙鏈斷裂。在DNA 雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制中，同源重組（homologous recombination，HR）修復(fù)發(fā)揮了重要作用。乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）能調(diào)控細(xì)胞周期中DNA修復(fù)和檢查點激活，使該基因與HR修復(fù)機(jī)制緊密相關(guān)[1-3]。重組酶51（recombinase 51，Rad51）是HR 修復(fù)機(jī)制的關(guān)鍵蛋白，在參與DNA 雙鏈斷裂損傷的HR修復(fù)中發(fā)揮重要作用。丙戊酸（valproic acid，VPA）是一種短鏈脂肪酸，具有抗腫瘤活性[4]，本課題組和其他研究小組均發(fā)現(xiàn)，VPA在治療癲癇病的血藥劑量（0.3～0.8 mmol·L-1）條件下能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長并具有放射增敏作用[2，5-7]。本課題組研究還發(fā)現(xiàn)，VPA 0.5 mmol·L-1可通過干擾BRCA1-Rad51介導(dǎo)的HR 修復(fù)機(jī)制，增加乳腺癌細(xì)胞的放射敏感性[2]。各種不同類型的癌癥中約50%會發(fā)現(xiàn)抑癌基因野生型p53（wild-type p53，wtp53）存在基因變異。p53在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、基因組的穩(wěn)定性、腫瘤發(fā)生和DNA損傷修復(fù)等一系列的細(xì)胞活動中均發(fā)揮重要作用。本課題組研究表明，抑癌基因p53 具有抑制HR修復(fù)過度增強(qiáng)的作用，以維持HR功能處于正常水平[8]。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，p53通過干擾細(xì)胞凋亡機(jī)制影響VPA的放射增敏作用，表現(xiàn)為VPA的放射增敏作用在wtp53細(xì)胞中尤為顯著；而對于p53缺欠（defective p53，dp53）的細(xì)胞，其放射增敏作用受到抑制[9]。本研究旨在探討在人乳腺癌MCF7細(xì)胞中，對于dp53細(xì)胞，VPA 的放射增敏作用是否受影響及其作用機(jī)制與HR修復(fù)功能之間的關(guān)系，為VPA用于臨床治療乳腺癌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人乳腺癌細(xì)胞MCF7（美國ATCC公司）。VPA、PLKO1、p53 shRNA慢病毒顆粒和甲紫（結(jié)晶紫）（美國Sigma公司）；pDR-GFP質(zhì)粒（Maria Jasin，Memorial Sloan Kattering Cancer 饋贈）；彗星實驗試劑盒（美國Invitrogen 公司）；DAPI 染液（美國Gene Copoeia 公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo Fisher公司）；小鼠抗兔P53、β肌動蛋白和磷酸化組蛋白（phosphorylated histone，γH2AX）抗體（一抗）（美國Millipore公司）；小鼠抗兔BRCA1抗體和兔抗小鼠Rad51 抗體（一抗）（美國Santa Cruz 公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體（二抗）（美國Thermo Fisher 公司）；ALexarFlour488熒光標(biāo)記雞抗兔IgG抗體和ALexarFlour594 熒光標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 抗體（二抗）（美國Molecular Probe 公司）。Primus S型醫(yī)用直線加速器（德國西門子公司）；IX70型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；FACS AriaⅢ型流式細(xì)胞儀（美國碧迪醫(yī)療公司）；5430R Eppendorf 離心機(jī)（美國Eppendorf公司）。

1.2 細(xì)胞系的建立

用含PLKO.1 或p53 shRNA 慢病毒顆粒液感染MCF7 細(xì)胞，建立p53 表達(dá)下調(diào)的同源配對MCF7 細(xì) 胞（MCF7/wtp53 和MCF7/dp53）[8]；向MCF7 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pDR-GFP，篩選穩(wěn)定表達(dá)pDRGFP 的MCF7/pDR-GFP 細(xì) 胞；用 含PLKO.1 或p53 shRNA 慢病毒顆粒液分別感染MCF7/pDRGFP 細(xì)胞，建立MCF7/pDR-GFP/wtp53 和MCF7/pDR-GFP/dp53細(xì)胞[7，9]。

1.3 Western印跡法檢測P53蛋白表達(dá)

取生長狀態(tài)良好的MCF7 細(xì)胞、MCF7/wtp53和MCF7/dp53細(xì)胞，按照每皿細(xì)胞總數(shù)3×106接種于p100培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)24 h，消化離心后，提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，按BCA試劑盒操作要求測定蛋白質(zhì)濃度，將樣品蛋白質(zhì)濃度調(diào)配一致，取總蛋白60 μg上樣，按照常規(guī)處理方法進(jìn)行電泳[2]。經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，6%脫脂奶粉封閉1 h，加入抗P53（1∶300）或β肌動蛋白（1∶1000）抗體后置搖床4 ℃孵育過夜，TBST 清洗3 次；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗室溫孵育1 h，加ECL 發(fā)光液暗室顯影，掃描分析蛋白條帶積分吸光度（integrated absorbance，IA），以P53 蛋白與β 肌動蛋白IA比值表示P53蛋白表達(dá)水平。

1.4 中性彗星實驗檢測DNA雙鏈斷裂損傷

取生長狀態(tài)良好的MCF7/wtp53 和MCF7/dp53細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按照每皿細(xì)胞總數(shù)2×105接種于不同p35培養(yǎng)皿，MCF7/wtp53和MCF7/dp53 細(xì)胞各分為4 組：細(xì)胞對照組、VPA 組（VPA 0.5 mmol·L-1處理24 h）、IR組（IR 8 Gy）和VPA+IR組（VPA 0.5 mmol·L-1預(yù)處理24 h后，IR 8 Gy）。IR處理后恢復(fù)30 min，按照常規(guī)處理方法進(jìn)行中性彗星實驗[10]，Cometscore 軟件分析細(xì)胞核拖尾情況。細(xì)胞核拖尾尾距越長，表明DNA雙鏈斷裂損傷越嚴(yán)重。雙鏈斷裂損傷程度（%）=彗星拖尾長度/細(xì)胞對照組彗星拖尾長度值×100%。

1.5 免疫熒光實驗檢測DNA 損傷標(biāo)志物γH2AX、HR修復(fù)蛋白Rad51和BRCA1的焦點形成

取生長狀態(tài)良好MCF7/wtp53 和MCF7/dp53細(xì)胞，按照每孔細(xì)胞總數(shù)2×104個接種于8 孔載玻片小室內(nèi)，分組和處理同1.4。IR 處理結(jié)束后恢復(fù)6 h，按常規(guī)方法進(jìn)行免疫熒光實驗[11]。通過倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)γH2AX，BRCA1和Rad51蛋白焦點形成，計數(shù)1000 個細(xì)胞中含蛋白焦點陽性細(xì)胞數(shù)。蛋白焦點形成判定：細(xì)胞核內(nèi)形成明亮而致密的點狀結(jié)構(gòu)即為焦點，每個細(xì)胞中含有大而明亮的焦點數(shù)目＞10，則可計為1個含γH2AX，BRCA1或Rad51蛋白焦點的陽性細(xì)胞。

1.6 細(xì)胞克隆形成實驗檢測細(xì)胞存活

取生長狀態(tài)良好的MCF7/wtp53 和MCF7/dp53細(xì)胞，按每皿接種細(xì)胞總數(shù)4×103，接種于p60培養(yǎng)皿，將2 種細(xì)胞各分為8 組：細(xì)胞對照組、VPA組（VPA 0.5 mmol·L-1處理24 h）、IR（IR 2，4和6 Gy）組及VPA+IR（IR 2，4 和6 Gy）組，每組3 個平行樣。處理結(jié)束后立即更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞克隆形成實驗[12]。繼續(xù)培養(yǎng)2 周后，肉眼可見細(xì)胞克隆形成則終止培養(yǎng)。濃度0.1%的甲紫工作液染色后，計數(shù)各組細(xì)胞克隆形成數(shù)目和細(xì)胞克隆形成率?？寺⌒纬陕剩?）=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測同源重組修復(fù)效率

取生長狀態(tài)良好的MCF7/pDR-GFP/wtp53 和MCF7/pDR-GFP/dp53 細(xì)胞，按每皿細(xì)胞總數(shù)（2～3）×105分別接種于p60細(xì)胞培養(yǎng)皿。2種細(xì)胞各分為2 組：細(xì)胞對照組和VPA 組（VPA 0.5 mmol·L-1處理24 h），VPA 處理前轉(zhuǎn)入核酸內(nèi)切酶I-sceI，藥物處理結(jié)束后更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)72 h后胰酶消化，117×g離心5 min后棄上清，PBS重懸，通過濾網(wǎng)過濾至流式細(xì)胞儀檢測管，用流式細(xì)胞儀檢測1×105個細(xì)胞，統(tǒng)計綠色熒光陽性的細(xì)胞數(shù)。HR修復(fù)效率（%）=綠色熒光陽性細(xì)胞數(shù)/100 000×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 P53表達(dá)下調(diào)的同源配對細(xì)胞模型的鑒定

Western 印跡實驗結(jié)果顯示，與MCF7 細(xì)胞相比，含PLKO.1病毒顆粒液感染MCF7細(xì)胞后，P53蛋白表達(dá)水平未變化；含p53 shRNA病毒顆粒液感染MCF7細(xì)胞后，P53蛋白表達(dá)水平顯著降低（圖1），提示成功培育p53 表達(dá)下調(diào)的同源配對細(xì)胞MCF7/wtp53和MCF7/dp53細(xì)胞。

2.2 VPA 對lR 所 致MCF7/wtp53 和MCF7/dp53細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷的影響

Fig.1 Expression level of protein P53 in human breast cancer MCF7，MCF7/wild type p53（wtp53）and MCF7/defective p53（dp53）cells. B was the semiquantiative result of A. IA：integrated absorbance. s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with MCF7 cell group.

彗星實驗結(jié)果（圖2A）顯示，①MCF7/wtp53細(xì)胞：與細(xì)胞對照組相比，IR 組細(xì)胞核拖尾尾距增加1.4 倍（P＜0.05），表明IR 能夠誘導(dǎo)MCF7 細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的DNA 雙鏈斷裂損傷；與IR 組相比，VPA+IR 組細(xì)胞核拖尾尾距增加1.8 倍（P＜0.05），說明VPA能增加IR誘導(dǎo)的MCF7細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷。②MCF7/dp53細(xì)胞：與細(xì)胞對照組相比，IR組細(xì)胞核拖尾尾距增加1.3倍（P＜0.05），表明IR仍可誘導(dǎo)DNA 雙鏈斷裂損傷；與IR 組相比，VPA+IR 組細(xì)胞核拖尾尾距雖增加1.2 倍（P＜0.05），但與MCF7/wtp53 細(xì)胞VPA+IR 組相比降低76.4%（P＜0.05），表明VPA增強(qiáng)IR誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂損傷的能力被抑制。由此提示，在MCF7/wtp53 細(xì)胞中，VPA 具有增強(qiáng)IR 誘導(dǎo)DNA 雙鏈斷裂損傷的作用；抑制p53表達(dá)后，VPA對IR的增強(qiáng)作用受到抑制。

免疫熒光結(jié)果（圖2B）顯示，①MCF7/wtp53細(xì)胞：與細(xì)胞對照組相比，IR組含γH2AX焦點細(xì)胞百分率升高39.1%（P＜0.05），表明IR 可誘導(dǎo)嚴(yán)重的DNA 雙鏈斷裂損傷；與IR 組相比，VPA+IR 組含γH2AX 焦點細(xì)胞百分率升高20.5%（P＜0.05），表明VPA能進(jìn)一步增強(qiáng)IR所致的乳腺癌細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷。②MCF7/dp53 細(xì)胞：與細(xì)胞對照組相比，IR 組含γH2AX 焦點細(xì)胞百分率升高16.7%（P＜0.05）；與IR組相比，VPA+IR 組含γH2AX焦點細(xì)胞百分率雖升高16.3%（P＜0.05），但相較于MCF7/wtp53 細(xì)胞VPA+IR 組仍降低30.0%（P＜0.05），表明VPA 增強(qiáng)IR 誘導(dǎo)雙鏈斷裂損傷的能力受到抑制。由此提示，在MCF7/wtp53 細(xì)胞中，IR可誘導(dǎo)嚴(yán)重的DNA 雙鏈斷裂損傷，且VPA 能增強(qiáng)IR 誘導(dǎo)的DNA 雙鏈斷裂損傷；抑制p53 表達(dá)后，VPA增強(qiáng)IR誘導(dǎo)DNA 雙鏈斷裂損傷的能力受到抑制，與彗星實驗結(jié)果相一致。

2.3 VPA 對lR 所 致MCF7/wtp53 和MCF7/dp53細(xì)胞存活的影響

Fig.2 Effect of valproic acid（VPA）on ionizing radiation（lR）-induced DNA double strand breaks（DSB）damage in MCF7/wtp53 and MCF7/dp53 cells. VPA group：VPA 0.5 mmol·L-1 treatment for 24 h；IR group：IR 8 Gy；VPA+IR group：VPA 0.5 mmol·L-1 pretreatment for 24 h，then IR 8 Gy. A：comet tail of the DNA damage A1 and comparison of comet tail length（A2）；B：expression of γH2AX focus formation，DNA DSB（B1）and percentage of cells containing γH2AX focus formation（B2）. s，n=3. ＊P＜0.05，compared with corresponding cell control group；#P＜0.05，compared with corresponding IR group；△P＜0.05，compared with VPA+IR group in MCF7/wtp53 cells.

細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果（圖3A和B）顯示，未給予IR 處理時，①MCF7/wtp53 細(xì)胞：與細(xì)胞對照組相比，VPA 組克隆形成率降低23.0%（P＜0.05）。②MCF7/dp53 細(xì)胞：細(xì)胞對照組克隆形成率與MCF7/wtp53 細(xì)胞的細(xì)胞對照組相比升高50.3%（P＜0.05）；與細(xì)胞對照組相比，VPA 組克隆形成率降低13.6%（P＜0.05），但與MCF7/wtp53 細(xì)胞VPA組相比仍升高59.7%（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of VPA on lR induced survival in MCF7/wtp53 and MCF7/dp53 cells. MCF7/wtp53 and MCF7/dp53 cells were divided into 8 groups respectively：cell control group，VPA group（VPA 0.5 mmol·L-1 treatment for 24 h），IR groups（IR 2，4 or 6 Gy）and VPA+IR groups（VPA 0.5 mmol·L-1 pretreatment for 24 h，IR 2，4 or 6 Gy）.A：the clone formation in MCF7/wtp53 and MCF7/dp53 cells；B：the plating efficiency was measured without IR treatment in MCF7/wtp53 and MCF7/dp53 cells；C：the survival fraction was measured in MCF7/wtp53 and MCF7/dp53 cells.，n=3. ＊P＜0.05，compared with cell control group in MCF7/wtp53 cells；#P＜0.05，compared with VPA group in MCF7/dp53 cells.

細(xì)胞在IR 處理后，隨著IR 劑量的增加，各組細(xì)胞克隆形成率均呈逐漸降低趨勢（圖3A和C）。①MCF7/wtp53 細(xì)胞：與IR（2 Gy）組相比，VPA+IR（2 Gy）組克隆形成率降低8.4%（P＜0.05）；與IR（4 Gy）組相比，VPA+IR（4 Gy）組克隆形成率降低20.4%（P＜0.05），表明VPA 能增強(qiáng)IR 殺傷MCF7細(xì)胞的能力。②MCF7/dp53細(xì)胞：IR（2 Gy）組克隆形成率與MCF7/wtp53 細(xì)胞IR（2 Gy）組相比升高5.9%（P＜0.05）；IR（4Gy）組克隆形成率與MCF7/wtp53 細(xì)胞IR（4 Gy）組相比升高17.1%（P＜0.05）；IR（6 Gy）組克隆形成率與MCF7/wtp53 細(xì)胞IR（6 Gy）組相比升高21.6%（P＜0.05），表明p53被抑制后，細(xì)胞對IR呈耐受狀態(tài)；VPA+IR（2 Gy）組克隆形成率與IR（2 Gy）組相比無明顯變化，但相較于MCF7/wtp53 細(xì)胞VPA+IR（2 Gy）組仍升高13.2%（P＜0.05）；VPA+IR（4Gy）組克隆形成率與IR（4Gy）組相比降低9.1%（P＜0.05），但相較于MCF7/wtp53 VPA+IR（4 Gy）組仍升高28.4%（P＜0.05）；VPA+IR（6 Gy）組克隆形成率與IR（6 Gy）組相比降低7.7%（P＜0.05），但相較于MCF7/wtp53 細(xì)胞VPA+IR（6 Gy）組仍升高13.8%（P＜0.05），表明在MCF7/dp53 細(xì)胞中，VPA 增強(qiáng)IR 殺傷細(xì)胞的能力受到抑制。結(jié)合彗星和免疫熒光實驗結(jié)果，提示在MCF7/wtp53 細(xì)胞中，VPA 能增強(qiáng)IR 誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂損傷以及IR對MCF7細(xì)胞的殺傷能力，即VPA 增加MCF7 細(xì)胞對IR 的敏感性，表現(xiàn)為VPA明顯的放射增敏作用；但抑制p53 表達(dá)后，VPA 的放射增敏作用受到抑制。

2.4 VPA在MCF7/wtp53和MCF7/dp53細(xì)胞中放射增敏作用的機(jī)制

Fig.4 Mechanism of homologous recombination（HR）repair in MCF/wtp53 and MCF7/dp53 cells. A：the effect of VPA 0.5 mmol·L-1 treatment for 24 h on HR efficiency；A1：flow cytometry；A2：HR efficiency. s，n=3. ＊P＜0.05，compared with cell control group in MCF7/pDR-GFP/wtp53 cells；#P＜0.05，compared with VPA group in MCF7/pDR-GFP/dp53 cells. B and C：BRCA1 and Rad51 focus formation；B1 and C1：BRCA1 and Rad51 focus formation；B2 and C2：the percentage of cells containing BRCA1 and Rad51 focus formation.DAPI was used to stain nucleus.See Fig.2 for the cell treatment.x±s，n=3.＊P＜0.05，compared with MCF7/wtp53 cell control group；#P＜0.05，compared with MCF7/wtp53 IR group；△P＜0.05，compared with MCF7/dp53 VPA+IR group.

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示（圖4A），①MCF7/pDRGFP/wtp53細(xì)胞：與細(xì)胞對照組相比，VPA組HR修復(fù)效率顯著降低51.6%（P＜0.05）。②MCF7/pDRGFP/dp53 細(xì)胞：細(xì)胞對照組與MCF7/pDR-GFP/wtp53細(xì)胞的細(xì)胞對照組相比，HR效率升高49.0%（P＜0.05）；與細(xì)胞對照組相比，VPA 組HR 效率降低20.3%（P＜0.05），但與MCF7/pDR-GFP/wtp53細(xì)胞VPA 組相比仍升高80.3%（P＜0.05）。結(jié)果提示，抑制p53表達(dá)后，HR修復(fù)能力增強(qiáng)。

免疫熒光實驗結(jié)果顯示（圖4B 和C），①MCF7/wtp53細(xì)胞：與細(xì)胞對照組相比，IR 組含BRCA1 焦點細(xì)胞百分率升高19.4%（P＜0.05），含Rad51焦點細(xì)胞百分率升高40.0%（P＜0.05），表明IR 能激活MCF7/wtp53 中BRCA1-Rad51 介導(dǎo)的HR 修復(fù)機(jī)制；與IR組相比，VPA+IR 組含BRCA1焦點細(xì)胞百分率降低15.6%（P＜0.05），含Rad51焦點細(xì)胞百分率降低20.4%（P＜0.05），提示IR 激活的BRCA1-Rad51介導(dǎo)HR修復(fù)機(jī)制被VPA抑制，表現(xiàn)為VPA的放射增敏作用。②MCF7/dp53 細(xì)胞：IR 組與MCF7/wtp53 細(xì)胞IR 組相比，含BRCA1 焦點細(xì)胞百分率升高31.7%（P＜0.05），含Rad51焦點細(xì)胞百分率升高27.6%（P＜0.05），表明抑制p53 表達(dá)后，IR激活的BRCA1-Rad51介導(dǎo)的HR機(jī)制處于過度增強(qiáng)狀態(tài)；與IR組相比，VPA+IR 組含BRCA1焦點細(xì)胞百分率降低5.8%（P＜0.05），含Rad51 焦點細(xì)胞百分率降低8.6%（P＜0.05），但與MCF7/wtp53細(xì)胞VPA+IR組相比，VPA+IR組含BRCA1焦點細(xì)胞百分率升高41.5%（P＜0.05），含Rad51焦點細(xì)胞百分率升高39.4%（P＜0.05），表明VPA 抑制IR 激活HR修復(fù)機(jī)制的能力受到影響，BRCA1-Rad51介導(dǎo)的HR 機(jī)制仍處于過度增強(qiáng)的狀態(tài)，表現(xiàn)為VPA的放射增敏作用受到抑制，細(xì)胞呈現(xiàn)放射耐受狀態(tài)。上述結(jié)果提示，抑制p53表達(dá)后，BRCA1-Rad51 介導(dǎo)的HR機(jī)制的過度增強(qiáng)可能與VPA對細(xì)胞放射增敏作用的下調(diào)有關(guān)。

3 討論

已有研究表明，VPA 作為抗腫瘤藥物，不但有效抑制癌細(xì)胞生長，且對多種腫瘤細(xì)胞具有放射增敏作用[2，5-7]。本課題組研究還表明，VPA放射增敏作用與DNA 損傷修復(fù)機(jī)制有關(guān)，可通過干擾BRCA1-Rad51 介導(dǎo)的HR 修復(fù)機(jī)制，增強(qiáng)IR 對乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用[2]。BRCA1 與Rad51 是HR修復(fù)中的關(guān)鍵蛋白，在DNA 雙鏈斷裂損傷修復(fù)中發(fā)揮重要的作用，提示VPA可能是極有應(yīng)用前景的腫瘤放療增敏劑，DNA 損傷修復(fù)蛋白（BRCA1 與Rad51 等）可能是其作用的靶點。本研究結(jié)果揭示，在MCF7/wtp53 細(xì)胞中，VPA 能顯著抑制其生長，增強(qiáng)MCF7/wtp53細(xì)胞對放射的敏感性；但相對于MCF7/wtp53細(xì)胞，MCF7/dp53細(xì)胞則表現(xiàn)出對放射的耐受，VPA 抑制其生長的能力降低，以及對MCF7/dp53細(xì)胞的放射增敏作用也被抑制，進(jìn)一步提示VPA的放射增敏作用是受p53功能狀態(tài)的影響。

已有研究報道，p53表達(dá)缺欠后，腫瘤對放療的敏感性受到抑制，表現(xiàn)出對放射治療的耐受性[13-14]，且該機(jī)制目前還不完全清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，在無應(yīng)激刺激時，p53 的表達(dá)缺欠導(dǎo)致BRCA1 和Rad51 活性增強(qiáng)，這與本課題組已往研究結(jié)果一致，是由于p53 表達(dá)缺欠導(dǎo)致的自發(fā)同源重組修復(fù)效率增強(qiáng)，表現(xiàn)為BRCA1和Rad51活性增強(qiáng)，這種增強(qiáng)作用可能與細(xì)胞復(fù)制阻滯有關(guān)[8]。本課題組已有研究表明，在HR修復(fù)過程中存在p53抑制HR和BRCA1 促進(jìn)HR 兩種截然不同的機(jī)制，維持2 種機(jī)制處于平衡狀態(tài)對于保證正常的HR修復(fù)功能具有重要意義，如果破壞這種平衡狀態(tài)將會影響腫瘤細(xì)胞對放射的敏感性[8]。當(dāng)p53 表達(dá)缺欠時，出現(xiàn)BRCA1和Rad51活性過度增強(qiáng)，HR修復(fù)能力也隨之過度增強(qiáng)，細(xì)胞呈現(xiàn)出對放射的耐受[8]。本研究結(jié)果提示，細(xì)胞在無IR 處理條件下，p53 缺欠就可引起MCF7/dp53 細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，此時VPA 抑制其生長的作用也顯著下降，其機(jī)制可能與BRCA1 和Rad51 活性以及HR 修復(fù)能力增強(qiáng)有關(guān)[8]。如用IR處理后，MCF7/dp53細(xì)胞對放射的敏感性顯著下降，此時VPA對其放射增敏作用也被顯著下調(diào)，MCF7/dp53 細(xì)胞呈現(xiàn)放射耐受狀態(tài)，其原因是在應(yīng)激狀態(tài)下，MCF7/dp53細(xì)胞仍然顯示出過強(qiáng)的BRCA1 和Rad51 活性與HR 修復(fù)能力，也提示p53依賴的VPA所致MCF7/dp53細(xì)胞放射耐受作用與細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力有關(guān)。

有研究表明，p53 基因突變見于＞50%腫瘤患者，而且p53 的表達(dá)狀態(tài)對腫瘤放療的療效和患者的預(yù)后有重要的意義[15]。本研究結(jié)果提示，應(yīng)用VPA 作為乳腺癌的放療增敏劑治療腫瘤時還應(yīng)考慮p53功能狀態(tài)，這為VPA用于臨床治療乳腺腫瘤提供了理論和實驗依據(jù)。