艾司洛爾對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠肺泡炎癥因子及氧化應(yīng)激蛋白的調(diào)控研究

(陜西省人民醫(yī)院急診內(nèi)科,陜西 西安 710068)

膿毒癥為感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，通常進(jìn)展速度快、患者預(yù)后差[1-2]。急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征是膿毒癥患者早期容易發(fā)生的癥狀，也是膿毒癥在臨床上引起死亡的主要原因[3]。因此，探索急性肺損傷的相關(guān)分子參與機(jī)制及治療對(duì)改善臨床預(yù)后具有重要價(jià)值。炎癥反應(yīng)因子的異常，尤其是白細(xì)胞介素家族水平的異常與肺損傷的病理過(guò)程密切相關(guān)，也是藥物治療效果的參考[4]；氧化應(yīng)激是氧化還原的失衡狀態(tài)，主要是由NOX蛋白家族參與的，其水平異常也參與了多種病理過(guò)程的肺損傷[5]。艾司洛爾為β受體阻滯劑，在肺損傷的治療過(guò)程中有積極的作用[6]，但目前尚未見(jiàn)到其對(duì)膿毒癥急性肺損傷模型作用的報(bào)道。本文分析艾司洛爾對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠肺泡炎癥因子及氧化應(yīng)激蛋白的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

清潔級(jí)雄性SD大鼠40只購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、模型組、地塞米松組和艾司洛爾組，每組10只。對(duì)照組和模型組大鼠給予生理鹽水(1 mL/kg)灌胃治療，地塞米松組(地塞米松0.25 mg/kg)和艾司洛爾組(艾司洛爾5 mg/kg)大鼠給予相對(duì)應(yīng)的藥物灌胃，每日一次，連續(xù)6天。末次給藥后對(duì)照組給予生理鹽水尾靜脈注射，其余各組給予內(nèi)毒素(3 mg/kg)尾靜脈注射造模。

1.2 試劑及儀器

艾司洛爾購(gòu)自Sigma Aldrich公司；白細(xì)胞介素2(interleukin2，IL-2)和IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)自R&D公司；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase2，NOX2)一抗購(gòu)自Cell Signaling公司；NOX4一抗購(gòu)自Santa Cruz公司；地塞米松購(gòu)自Sigma Aldrich公司；其余試劑為市售分析純。垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及凝膠成像儀均購(gòu)自Bio Rad公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自累杜公司；移液器及冷凍離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司。

1.3 肺功能指標(biāo)分析

各組動(dòng)物造模24 h后進(jìn)行麻醉，開(kāi)腹，用經(jīng)肝素抗凝處理過(guò)的血?dú)夥治鰧Ｓ米⑸淦鞲怪鲃?dòng)脈采血1 mL用血?dú)夥治鰞x進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治?，測(cè)定其氧分壓。取各組大鼠血漿及支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)少許稱重，溴甲酚氯法測(cè)定血漿及BALF蛋白含量，計(jì)算LPI(LPI=BALF蛋白含量/血漿蛋白含量)。

1.4 Blotting法檢測(cè)相關(guān)蛋白

配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，以等量總蛋白進(jìn)行上樣，以90 V電壓在濃縮膠中電泳。電泳30 min后把電壓升高至120 V，當(dāng)溴酚藍(lán)染料達(dá)到底部邊緣以后，停止電泳，取出蛋白凝膠。把凝膠上的蛋白在90V電壓條件下電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。取出硝酸纖維素膜，放在100 g/L的脫脂奶粉中，室溫條件孵育2 h。將一抗用磷酸鹽緩沖液以1∶800稀釋以后，與NC膜反應(yīng)，反應(yīng)條件為：4 ℃過(guò)夜。再將辣根過(guò)氧化酶(Horseradish Peroxidase, HRP)標(biāo)記的二抗用磷酸鹽緩沖液以1∶3 000稀釋，于室溫中孵育2 h。用電化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，以Image Quant Las 4000 min拍照分析灰度值，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間存在差異再進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 艾司洛爾對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠肺功能的影響分析

與對(duì)照組相比，模型組大鼠的肺功能指標(biāo)呼吸頻率、肺泡通透指數(shù)均明顯升高(P<0.05)，PaO2明顯降低(P<0.05)，而地塞米松組和艾司洛爾組的上述指標(biāo)得到明顯恢復(fù)(P<0.05)，且艾司洛爾組恢復(fù)更明顯(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 艾司洛爾對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠肺功能的影響分析

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與地塞米松組比較，cP<0.05(n=10)

2.2 艾司洛爾干預(yù)后肺泡炎癥因子水平變化分析

與對(duì)照組相比，模型組大鼠的炎癥因子IL-2及IL-6水平均明顯升高(P<0.05)，而地塞米松組和艾司洛爾組的上述指標(biāo)得到明顯恢復(fù)(P<0.05)，且艾司洛爾組恢復(fù)更明顯(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 艾司洛爾干預(yù)后肺泡氧化應(yīng)激蛋白水平變化分析

與對(duì)照組相比，模型組大鼠的氧化應(yīng)激蛋白NOX2及NOX4水平均明顯升高(P<0.05)，而地塞米松組和艾司洛爾組的上述指標(biāo)得到明顯恢復(fù)(P<0.05)，且艾司洛爾組恢復(fù)更明顯(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

表2 艾司洛爾干預(yù)后肺泡炎癥因子水平變化分析

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與地塞米松組比較，cP<0.05

圖1 艾司洛爾干預(yù)后肺泡氧化應(yīng)激蛋白水平變化分析與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與地塞米松組比較，△P<0.05

3 討 論

膿毒癥是臨床上的常見(jiàn)疾病，通常會(huì)引起急性肺損傷，給患者生存狀態(tài)帶來(lái)明顯的不利影響。但目前關(guān)于膿毒癥引起急性肺損傷的相關(guān)分子機(jī)制尚不明確，可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷有關(guān)。目前臨床上對(duì)膿毒癥急性肺損傷的治療通常采用早期抗生素、中期糖皮質(zhì)激素聯(lián)合血管活性藥物，但效果通常不佳。本研究在分析艾司洛爾對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠肺泡炎癥因子及氧化應(yīng)激蛋白的調(diào)控作用時(shí)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，模型組大鼠的肺功能指標(biāo)呼吸頻率、肺泡通透指數(shù)均明顯升高，PaO2明顯降低，模型組大鼠的炎癥因子IL-2和IL-6、NOX2及NOX4水平均明顯升高；而地塞米松組和艾司洛爾組的上述指標(biāo)得到明顯恢復(fù)，且艾司洛爾組恢復(fù)更明顯，提示艾司洛爾能顯著改善膿毒癥急性肺損傷，可能與其調(diào)控大鼠肺泡炎癥因子及氧化應(yīng)激蛋白的水平有關(guān)。

以往的研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素水平與急性肺損傷及藥物的治療效果有關(guān)[7-8]。在分析香菇多糖對(duì)膿毒癥小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)香菇多糖通過(guò)抑制IL-6、IL-1β信號(hào)分子而發(fā)揮抗炎作用，對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)急性肺損傷有保護(hù)作用[9]。在分析骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)急性肺損傷幼鼠炎癥因子IL-1β、IL-10的影響時(shí)也證實(shí)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)后，急性肺損傷幼年鼠的肺組織損傷減輕，并且IL-1β、IL-10蛋白表達(dá)較模型組顯著降低，提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠減輕急性肺損傷肺組織的炎癥反應(yīng)并參與了肺組織損傷的修復(fù)[10]。在分析人參皂苷預(yù)處理對(duì)急性肺損傷大鼠腫瘤壞死因子-α和IL-6及IL-10水平的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)人參皂苷可能通過(guò)上調(diào)IL-10的表達(dá)及下調(diào)IL-6的表達(dá)來(lái)保護(hù)大鼠的急性肺損傷[11]。在分析IL-1β與IL-18在急性肺損傷中的表達(dá)及臨床意義時(shí)證實(shí)細(xì)胞凋亡是急性肺損傷患者的重要病理機(jī)制之一，急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展和IL-1β與IL-18的參與有關(guān)[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的炎癥因子IL-2和IL-6水平均明顯升高；而地塞米松組和艾司洛爾組的上述指標(biāo)得到明顯恢復(fù)，且艾司洛爾組恢復(fù)更明顯，提示艾司洛爾能顯著改善膿毒癥急性肺損傷，可能與其調(diào)控大鼠肺泡炎癥因子水平的機(jī)制有關(guān)。氧化應(yīng)激也參與了肺損傷的病理學(xué)過(guò)程，且藥物能夠通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激的異常狀態(tài)改善肺功能指標(biāo)[13-14]。在分析膿毒癥大鼠模型心肌組織和肺組織中活性氧含量與組織損傷、細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究中也發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠模型心肌組織和肺組織中反應(yīng)氧自由基生成增多能夠引起組織損傷以及細(xì)胞凋亡[15]。艾司洛爾聯(lián)合米力農(nóng)治療膿毒癥合并心功能不全的作用可能與其抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)、降低血乳糖來(lái)發(fā)揮作用[16]，且艾司洛爾提高肺葉切除患者早期肺氧合功能也與其抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)機(jī)制有關(guān)[17]。艾司洛爾聯(lián)合去甲腎上腺素治療膿毒性休克患者心功能障礙和血流動(dòng)力學(xué)異常也是通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的[18]。本研究中也發(fā)現(xiàn)艾司洛爾能降低模型組血清中炎癥因子水平，提示其作用的機(jī)制也是與其調(diào)節(jié)炎癥因子水平異常有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的NOX2及NOX4水平均明顯升高；而地塞米松組和艾司洛爾組的上述指標(biāo)得到明顯恢復(fù)，且艾司洛爾組恢復(fù)更明顯，提示艾司洛爾能顯著改善膿毒癥急性肺損傷，可能與其調(diào)控大鼠肺泡氧化應(yīng)激蛋白的水平有關(guān)。

因此，艾司洛爾能顯著改善膿毒癥急性肺損傷，可能與其調(diào)控大鼠肺泡炎癥因子及氧化應(yīng)激蛋白的水平有關(guān)。