理氣導(dǎo)滯法對(duì)慢傳輸型便秘小鼠結(jié)腸動(dòng)力的促進(jìn)作用

陳 霞, 溫偉波, 張 鵬

(1.云南省中醫(yī)醫(yī)院,云南 昆明650021；2.云南省第一人民醫(yī)院,云南 昆明650000)

慢傳輸型便秘是臨床常見(jiàn)的頑固性功能性便秘,其特征是結(jié)腸推進(jìn)力減弱,內(nèi)容物通過(guò)減慢,病因至今尚不清楚［1］,導(dǎo)致治療困難［2］。目前,由中胚層間充質(zhì)細(xì)胞分化而來(lái)的Cajal 間質(zhì)細(xì)胞,特別位于環(huán)行肌與縱行肌間隙中的,被證實(shí)是胃腸運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生節(jié)律性慢波的主要起搏細(xì)胞［3］,大量研究也將其作為治療慢傳輸型便秘的靶向目標(biāo)。課題組前期經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐,總結(jié)出治療慢傳輸型便秘的理氣導(dǎo)滯法［4］,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方法對(duì)腸道傳輸功能有明顯改善作用［5］；本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上,探討其對(duì)慢傳輸型便秘小鼠結(jié)腸動(dòng)力的促進(jìn)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康成年清潔級(jí)昆明種雄性小鼠,體質(zhì)量(21±2) g,由北京華埠生物科技股份有限公司提供,飼養(yǎng)于云南省中醫(yī)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用許可證號(hào)SCXK(京) 2014-0004,于室溫10 ～20 ℃、相對(duì)濕度50%～70%、清潔安靜環(huán)境的條件下采用架式分籠養(yǎng)飼養(yǎng),每天正常進(jìn)食飲水。動(dòng)物觀察為開(kāi)放式,照明、換氣等條件控制在規(guī)定范圍內(nèi),為了減少腸易激的影響,實(shí)驗(yàn)前分別進(jìn)行7 d 環(huán)境適應(yīng)期、5 d 生理鹽水灌胃期。

1.2 試藥 理氣導(dǎo)滯法組方采用四逆散加陳皮、炒厚樸、黃芪、生白術(shù)、苦杏仁、火麻仁、全瓜蔞、檳榔,藥材選用中藥免煎顆粒劑(江陰天江藥業(yè)有限公司,批號(hào)醋柴胡18072211、白 芍18082191、 炒 枳 殼18081371、 全 瓜 蔞18071411、陳 皮18061111、 炒 厚 樸18061051、 苦 杏 仁18091531、甘 草18071941、 火 麻 仁18070411、 郁 李 仁18060881、 黃 芪 18080041、 生 白 術(shù) 18091041、 檳 榔1609180),造模選用鹽酸洛哌丁胺膠囊(西安楊森制藥有限公司,批號(hào)160912319),陽(yáng)性對(duì)照選用枸櫞酸莫沙比利片(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)160904),制成相應(yīng)混懸液備用。

2 方法

2.1 分組 實(shí)驗(yàn)前將適應(yīng)性飼養(yǎng)后的50 只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及理氣導(dǎo)滯法組方高、低劑量組(根據(jù)人-小鼠等效劑量換算得出高劑量組,以及高劑量半量的低劑量組),每組10 只。各組小鼠在精神、活動(dòng)、體質(zhì)量、排便分布情況上無(wú)明顯差異,具有可比性。

2.2 造模 參照文獻(xiàn)［6］,采用阿片受體激動(dòng)劑——鹽酸洛哌丁胺膠囊建立慢傳輸型便秘小鼠模型。除正常組外,其余各組小鼠灌胃給予膠囊混懸液(10 mg/kg),連續(xù)3 d,其間正常進(jìn)食飲水；正常組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水,以避免干擾。

2.3 給藥 造模3 d 后,陽(yáng)性組小鼠灌胃給予枸櫞酸莫沙比利(2 mg/kg),理氣導(dǎo)滯法組方高、低劑量組小鼠分別灌胃給予26、13 g/kg 方劑,正常組、模型組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水,造模、干預(yù)灌胃給藥間隔30 min,連續(xù)4 d。其間正常進(jìn)食飲水,每天監(jiān)測(cè)體質(zhì)量、精神、活動(dòng)、排便情況。

2.4 指標(biāo)檢測(cè) 將小鼠放入鋪有濾紙的鼠籠內(nèi),每籠放1只,每天定時(shí)收集并記錄小鼠糞便頻次、份量、質(zhì)地、首次排便時(shí)間,電子天平稱量24 h 糞便濕重,以及經(jīng)電熱恒溫干燥箱干燥后的糞便干重,計(jì)算24 h 糞便干、濕重之差(24 h 糞便濕重-24 h 糞便干重) 以反映糞便含水量。

最后一次給藥后小鼠禁食禁水24 h,取0.4 mL 活性炭混懸液模擬腸內(nèi)容物灌胃,90 min 后頸椎脫臼法處死,迅速剖開(kāi)腹腔,取出賁門至直腸末端的腸道,幽門處離斷,觀察胃排空程度,再輕輕將腸管置于托盤中拉直,在松弛狀態(tài)下測(cè)量活性炭混懸液在腸道內(nèi)推進(jìn)的長(zhǎng)度及腸道的全長(zhǎng),計(jì)算活性炭混懸液推進(jìn)長(zhǎng)度占腸道全長(zhǎng)比例(炭末混懸液前端與幽門的距離/腸道總長(zhǎng)度×100%) 以反映腸道傳輸功能。

每組隨機(jī)選擇5 只小鼠分離結(jié)腸組織,取升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸、直腸組織各約1.0 cm,光鏡下觀察全結(jié)腸改變,其中整個(gè)肌層包括平滑肌細(xì)胞、肌間叢神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等。然后,測(cè)定結(jié)腸腸肌叢Cajal 間質(zhì)細(xì)胞CD117 表達(dá)、結(jié)腸Cajal 間質(zhì)細(xì)胞c-kit 表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS19.0 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)用表示,多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況 各組小鼠存活率均為100%,實(shí)驗(yàn)期間其進(jìn)食飲水、精神活動(dòng)、皮膚毛發(fā)均正常。表1 顯示,模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及理氣導(dǎo)滯法組方高、低劑量組小鼠體質(zhì)量均顯著大于正常組(P＜0.05),并且各組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表1 理氣導(dǎo)滯法對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響n=10）

表1 理氣導(dǎo)滯法對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響n=10）

注：與正常組比較,*P＜0.05

組別 體質(zhì)量/g正常組 20.91±0.64模型組 21.77±0.36*陽(yáng)性對(duì)照組 21.49±0.51*理氣導(dǎo)滯法組方高劑量組 21.59±0.66*理氣導(dǎo)滯法組方低劑量組 21.74±0.56*

3.2 理氣導(dǎo)滯法對(duì)小鼠糞便含水量的影響 由于各組數(shù)據(jù)方差不齊,不符合正態(tài)分布,故通過(guò)K-S 秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。結(jié)果,正常組、模型組小鼠糞便含水量無(wú)顯著差異(P＞0.05),陽(yáng)性對(duì)照組、理氣導(dǎo)滯法組小鼠其含水量與模型組比較亦然(P＞0.05)。

3.3 理氣導(dǎo)滯法對(duì)小鼠胃腸動(dòng)力的影響

3.3.1 胃排空 圖1 顯示,正常組、陽(yáng)性對(duì)照組、理氣導(dǎo)滯法組方高劑量組小鼠胃排空情況很好,理氣導(dǎo)滯法組方低劑量組小鼠情況較好,模型組小鼠有大量潴留。

3.3.2 腸道傳輸功能 表2 顯示,模型組小鼠腸推進(jìn)距離顯著短于正常組(P＜0.05),理氣導(dǎo)滯法組方組小鼠其距離顯著長(zhǎng)于模型組(P＜0.01)。

圖1 各組小鼠胃排空情況

表2 理氣導(dǎo)滯法對(duì)小鼠腸道傳輸功能的影響（，n=10）

表2 理氣導(dǎo)滯法對(duì)小鼠腸道傳輸功能的影響（，n=10）

注：與正常組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01

組別 腸推進(jìn)距離/cm正常組 58.18±13.02模型組 45.92±8.05*陽(yáng)性對(duì)照組 59.40±13.58＃理氣導(dǎo)滯法組方高劑量組 59.97±8.27＃＃理氣導(dǎo)滯法組方低劑量組 61.80±19.24＃＃

3.4 理氣導(dǎo)滯對(duì)小鼠結(jié)腸黏膜影響 圖2 顯示,與正常組比較,模型組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜呈輕度慢性炎癥改變,理氣導(dǎo)滯法組方組小鼠結(jié)腸黏膜炎癥改變較少。

3.5 理氣導(dǎo)滯法對(duì)小鼠結(jié)腸腸肌叢Cajal 間質(zhì)細(xì)胞CD117的影響

3.5.1 免疫組化染色 圖3 顯示,模型組小鼠結(jié)腸c-kit標(biāo)記的腸肌叢Cajal 間質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)較正常組明顯減少,陽(yáng)性對(duì)照組、理氣導(dǎo)滯法組方組其陽(yáng)性表達(dá)與模型組相比均有所升高。

圖2 各組小鼠乙狀結(jié)腸黏膜HE 染色（×100）

圖3 各組小鼠Cajal 間質(zhì)細(xì)胞免疫組化圖（模型組×100，其他組×200）

3.5.2 細(xì)胞計(jì)數(shù) 表3 顯示,模型組小鼠Cajal 間質(zhì)細(xì)胞數(shù)較正常組顯著降低(P＜0.05),理氣導(dǎo)滯法組方高劑量組小鼠其數(shù)量與模型組比較顯著升高(P＜0.05),而低劑量組無(wú)顯著變化(P＞0.05)。

表3 理氣導(dǎo)滯法對(duì)小鼠Cajal 間質(zhì)細(xì)胞數(shù)的影響n=5）

表3 理氣導(dǎo)滯法對(duì)小鼠Cajal 間質(zhì)細(xì)胞數(shù)的影響n=5）

注：與正常組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01

組別 Cajal 間質(zhì)細(xì)胞/個(gè)正常組 27.00±12.93模型組 17.22±6.55*陽(yáng)性對(duì)照組 34.44±19.77＃＃理氣導(dǎo)滯法組方高劑量組 25.32±11.32＃理氣導(dǎo)滯法組方低劑量組 22.24±11.72

3.6 理氣導(dǎo)滯法對(duì)c-kit 相對(duì)表達(dá)量的影響 表4 顯示,模型組c-kit 相對(duì)表達(dá)量較正常組顯著升高(P＜0.05),理氣導(dǎo)滯法組方高劑量組其相對(duì)表達(dá)量與模型組比較顯著降低(P＜0.01),而低劑量組無(wú)顯著變化(P＞0.05)。

表4 理氣導(dǎo)滯法對(duì)c-kit 相對(duì)表達(dá)量的影響n=5）

表4 理氣導(dǎo)滯法對(duì)c-kit 相對(duì)表達(dá)量的影響n=5）

注：與正常組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01

組別 c-kit 相對(duì)表達(dá)量正常組 0.36±0.01模型組 1.56±0.38*陽(yáng)性對(duì)照組 0.98±0.37＃理氣導(dǎo)滯法組方高劑量組 0.77±0.46＃＃理氣導(dǎo)滯法組方低劑量組 1.13±0.51

4 討論

近年來(lái)流行病學(xué)調(diào)查顯示,全球范圍便秘發(fā)病率為0.7%～79%［7］,國(guó)內(nèi)為3%～17%［8］,其中慢傳輸型便秘發(fā)病率高居各種便秘亞型之首［9］,其病因復(fù)雜不清,可靠有效的治療方法仍然在探索中。中醫(yī)認(rèn)為,它屬“便秘” 范疇,患者有“排便費(fèi)力、便不盡感” 的特征,氣滯貫穿病程始終,治療時(shí)應(yīng)從理氣導(dǎo)滯入手,通過(guò)調(diào)整逆亂氣機(jī),消除腸道積滯,最終產(chǎn)生有效蠕動(dòng),緩解結(jié)腸動(dòng)力不足。

理氣導(dǎo)滯法組方由調(diào)暢氣機(jī)經(jīng)典方四逆散化裁而來(lái),方中柴胡、芍藥、陳皮疏肝理氣,配伍枳實(shí)、厚樸、檳榔消積導(dǎo)滯,黃芪、白術(shù)健脾益氣助運(yùn),火麻仁、苦杏仁、全瓜蔞清熱潤(rùn)腸,佐甘草緩急和中,全方疏肝理氣、消痞導(dǎo)滯、通補(bǔ)兼顧?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),四逆散可明顯促進(jìn)胃腸動(dòng)力［10-11］,其提取物具有增強(qiáng)胃腸動(dòng)力的作用［12］,柴胡、枳實(shí)、白術(shù)、檳榔對(duì)腸道傳輸也有明顯促進(jìn)作用［13］,結(jié)合臨床療效推測(cè)理氣導(dǎo)滯法能提高胃腸傳輸,上調(diào)Cajal 間質(zhì)細(xì)胞功能,故構(gòu)建慢傳輸型便秘小鼠模型。結(jié)果顯示,理氣導(dǎo)滯法能改善小鼠腸道傳輸能力,以高劑量組更明顯,并且對(duì)糞便含水量未產(chǎn)生明顯影響,提示該方法改善了小鼠便秘情況,對(duì)慢傳輸型便秘具有良好的治療作用,而且不同于其他刺激性瀉劑,該作用不是增加糞便水分,而是促進(jìn)腸道蠕動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

特異性標(biāo)志物酪氨酸蛋白激酶受體c-kit (又名CD117)［14］可標(biāo)示產(chǎn)生消化道慢波電位的“起搏點(diǎn)” ——Cajal 間質(zhì)細(xì)胞,其數(shù)量和分布不同均可導(dǎo)致結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能紊亂。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法,用CD117 標(biāo)記小鼠結(jié)腸Cajal 間質(zhì)細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)慢傳輸型便秘模型小鼠位于環(huán)行肌與縱行肌間隙中的CD117 標(biāo)記Cajal 間質(zhì)細(xì)胞數(shù)明顯減少,而理氣導(dǎo)滯法干預(yù)后其顯著上調(diào),以高劑量組更明顯,表明理氣導(dǎo)滯法治療慢傳輸型便秘與增加結(jié)腸腸肌叢Cajal 間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量密切相關(guān)。另外,造模后小鼠結(jié)腸c-kit 相對(duì)表達(dá)量明顯升高,而理氣導(dǎo)滯法干預(yù)后有所減低,以高劑量組更明顯。結(jié)合Grabarek［15］對(duì)正常人骨髓干細(xì)胞表面c-kit受體表達(dá)隨造血細(xì)胞發(fā)育成熟呈現(xiàn)變化的趨勢(shì)提示,理氣導(dǎo)滯法治療慢傳輸型便秘可能與Cajal 間質(zhì)細(xì)胞,特別是成熟者的數(shù)量密切相關(guān)。