芪歸益腎方對小鼠腎臟纖維化的延緩作用

尹歸東, 席 一, 魏 祥, 魏明剛*

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院,江蘇 蘇州215006；2.寧鄉(xiāng)市中醫(yī)醫(yī)院,湖南 長沙410600)

慢性腎臟病病因復(fù)雜,病情易反復(fù),其不斷進展的主要原因是腎組織內(nèi)炎癥因子與抗炎癥相關(guān)因子之間的失衡,導(dǎo)致組織內(nèi)過度炎癥反應(yīng)及組織損傷,從而引起纖維組織增生,同時腎組織內(nèi)固有細胞轉(zhuǎn)分化,如小管上皮細胞向成纖維細胞轉(zhuǎn)化,分泌過多的細胞外基質(zhì),共同促成腎臟纖維化［1］。因此,如何減輕腎臟組織內(nèi)炎癥反應(yīng),阻止腎臟纖維化發(fā)生,往往是治療慢性腎臟病的關(guān)鍵。

近年來研究表明,血液系統(tǒng)中某些凝血、纖溶相關(guān)物質(zhì)與腎組織內(nèi)炎癥反應(yīng)和纖維化有關(guān),如腎血管內(nèi)皮細胞膜上的凝血酶調(diào)節(jié)蛋白(TM) 和凝血酶結(jié)合可活化蛋白質(zhì)C(PC),活化的后者與內(nèi)皮細胞蛋白質(zhì)C 受體(EPCR) 結(jié)合而影響下游信號分子,可減輕腎臟的炎性損傷［2-3］。隨著腎組織內(nèi)炎癥反應(yīng)發(fā)生,纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1) 在系膜細胞、內(nèi)皮細胞、小管上皮細胞上表達增加［4］,它可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2、纖溶酶活性來減少細胞外基質(zhì)的降解,從而引起腎組織中細胞外基質(zhì)的沉積［5-6］。

本課題組具有自主知識產(chǎn)權(quán)的方劑——芪歸益腎方具有健脾益腎、活血通絡(luò)的功效,前期基礎(chǔ)與臨床研究中已證實它具有減輕蛋白尿、延緩腎臟纖維化的作用［7-9］。中醫(yī)“活血通絡(luò)” 與西醫(yī)“凝血” “纖溶” 有相通之處,故推測芪歸益腎方可能通過影響凝血、纖溶相關(guān)物質(zhì)來發(fā)揮減輕腎組織內(nèi)炎癥反應(yīng)、延緩腎臟纖維化的作用,并通過本實驗來驗證這個觀點。

1 材料

1.1 動物 雄性ICR 小鼠40 只,SPF 級,體質(zhì)量(20±2) g,由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號SYXK(蘇)2017-0043。

1.2 試藥 PAI-1 抗體(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,批號DK8014)；TGF-β1 抗體(批號AH03071206)、山羊抗大鼠二抗(批號133974)［愛必信(上海) 生物科技有限公司］；Thrombomodulin 抗 體 (美 國 R＆D 公 司, 批 號cakk031805A)；Fibronectin 抗體(武漢博士德生物工程有限公司,批號153188)；山羊抗兔二抗(批號167976)、Tubulin 抗體(批號166453) (杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；鹽酸貝那普利片(北京諾華制藥有限公司,批號x2615)；磷酸川芎嗪片(麗珠集團麗珠制藥廠,批號170901)。芪歸益腎方藥材(黃芪30 g、太子參15 g、芡實30 g、金櫻子30 g、當歸15 g、牛膝15 g、川芎15 g、炒白術(shù)15 g、白花蛇舌草30 g、蟬蛻12 g、甘草6 g,批號180218010) 由蘇州天靈藥業(yè)有限公司提供,經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部毛葉勤副主任中藥師鑒定為正品,均符合2015 年版《中國藥典》 相關(guān)要求,由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室經(jīng)煎煮、濃縮方法制備成混懸液,生藥量1 g/mL。

1.3 儀器 電泳儀、 電泳槽、 轉(zhuǎn)移槽、 GelDoc XR+全自動凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司)；SpectraMax 190 光吸收酶標儀(美谷分子儀器有限公司)； Axio Imager M1m 顯微鏡 (德國ZEISS公司)。

2 方法

2.1 造模［10］小鼠用2%戊巴比妥麻醉后,進行左側(cè)輸尿管阻斷術(shù)。小鼠固定于手術(shù)臺,腹部消毒,沿腹正中線切開皮膚、肌層,剪開腹膜,暴露左側(cè)腎臟、輸尿管,用5/0 絲線結(jié)扎輸尿管兩道,逐層縫合關(guān)腹,假手術(shù)組僅開腹并游離左側(cè)輸尿管,但不結(jié)扎輸尿管,其余步驟與手術(shù)組相同,4 ℃生理鹽水從左心室注入,剪開右心耳流出血液,灌洗體循環(huán)血液,快速剖取左腎,一部分以4%多聚甲醛溶液固定,用于組織染色和免疫組織化學(xué)檢測；另一部分迅速置于液氮中, 儲存于-80 ℃冰箱,用于Western blot 檢測。

2.2 分組及給藥 將40 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周,自由飲水、 進食, 隨機分為芪歸益腎方組(10 g/kg),貝那普利組(10 mg/kg)、川芎嗪組(100 mg/kg)、模型組(生理鹽水10 mL/kg)、假手術(shù)組(生理鹽水10 mL/kg)。造模成功2 d 后,連續(xù)灌胃給藥10 d。

2.3 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 小鼠腎組織石蠟切片3 μm,進行HE、Masson 染色,光鏡下觀察,以半定量方法評估腎小管間質(zhì)纖維化程度。每個標本切片觀察20 個200 倍不重疊視野,以每個視野中腎小管擴張、炎癥細胞浸潤、腎小管萎縮和管型形成、間質(zhì)細胞外基質(zhì)沉積范圍占總視野比例計算腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)：0 分,正常；1 分,＜10%；2 分,11%～25%；3 分,26%～50%；4 分,51%～75%；5 分,＞75%。

2.4 免疫組化檢測 小鼠腎組織石蠟切片,常規(guī)脫蠟入水,3%H2O2孵育10 min,消除內(nèi)源性過氧化物酶活性后PBS 洗滌3 次,微波抗原修復(fù),5%牛血清蛋白封閉20 min,PBS 洗滌3 次,加入一抗,4 ℃下孵育過夜(Fibronectin 一抗稀釋比例為1 ∶100, PAI-1 為1 ∶100, TGF-β1 為1 ∶400,Thrombomodulin 為1 ∶100),次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h,PBS 洗滌3 次,DAB 顯色,蒸餾水沖洗,蘇木素復(fù)染7 min,鹽酸乙醇分化數(shù)秒使細胞核呈紫藍色,加氨水數(shù)秒至返藍,蒸餾水沖洗。然后,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,樹膠封片,光鏡下棕黃色顆粒區(qū)域為陽性表達,每張切片隨機尋找20 個400 倍不重疊視野,Image Pro Plus 6.0 軟件進行分析,以陽性面積/視野總面積表示蛋白表達量。

2.5 Western blot 檢測 取-80 ℃下保存的小鼠腎組織,加入RIPA 裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)并進行組織研磨,提取組織總蛋白后測定其濃度。每孔加40 μg 總蛋白上樣,進行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE) 電泳,濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。 加入含5%牛血清白蛋白(BSA) 的TBST 緩沖液,室溫下封閉l h,再加入一抗,4 ℃下孵育過夜(Fibronectin 一抗稀釋比例為1 ∶400,PAI-1 為1 ∶1 000, TGF-β1 為1 ∶1 000,Thrombomodulin 為1 ∶1 000,Tubulin 為1 ∶5 000),洗膜,加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶2 000),室溫下孵育1 h,洗膜,ECL 試劑曝光顯影。Image Pro Plus 6.0 軟件進行分析,通過目的蛋白與內(nèi)標Tubulin 的灰度比值計算目的蛋白相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 17.0 軟件進行處理,符合正態(tài)分布的計量資料以表示,組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠左側(cè)腎臟外觀 芪歸益腎方組、貝那普利組、川芎嗪組、模型組小鼠左側(cè)腎臟(結(jié)扎腎)體積相比假手術(shù)組(未結(jié)扎腎) 明顯增大,腎臟包膜緊張呈半透明狀,可見黃色半透明的液體。梗阻側(cè)腎臟縱向剖開后,可見血性或者乳白色積液流出,剖面觀可見腎盂明顯擴張,腎皮質(zhì)明顯變薄。

3.2 小鼠腎組織病理變化 HE 染色顯示,假手術(shù)組小鼠腎小球、腎小管及間質(zhì)正常,芪歸益腎方組、貝那普利組、川芎嗪組、模型組都有不同程度腎小管擴張、炎癥細胞浸潤、腎小管管型形成、間質(zhì)細胞外基質(zhì)沉積；Masson 染色顯示,小鼠腎臟膠原染色呈藍色,假手術(shù)組無藍色染色,芪歸益腎方組、貝那普利組、川芎嗪組、模型組都有不同程度的藍色染色,主要位于腎小囊、系膜區(qū)和腎小管的毛細血管周圍及腎小管周圍間質(zhì)部分。模型組小鼠腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)顯著高于芪歸益腎方組、貝那普利組、川芎嗪組(P＜0.05),而芪歸益腎方組又顯著低于貝那普利組、川芎嗪組(P＜0.05)。見圖1。

3.3 免疫組化檢測 與假手術(shù)組比較,芪歸益腎方組、貝那普利組、川芎嗪組、模型組腎組織中TGF-β1、PAI-1、FN 表達顯著升高 (P ＜0.05),TM 表達顯著降低(P＜0.05)；與模型組比較,芪歸益腎方組、貝那普利組、川芎嗪組前三者表達顯著降低 (P ＜0.05), 后者表達顯著升高 (P ＜0.05),以芪歸益腎方組更明顯(P ＜0.05)。見圖2。

圖1 各組小鼠腎組織病理變化（×200）Fig.1 Renal pathological changes of mice in various groups（×200）

3.4 Western blot 檢測 與假手術(shù)組比較,芪歸益腎方組、貝那普利組、川芎嗪組、模型組腎組織中FN、TGF-β1、PAI-1 表達顯著增加 (P ＜0.05),TM 表達顯著降低(P＜0.05)；與模型組比較,芪歸益腎方組、貝那普利組、川芎嗪組前三者表達顯著降低 (P ＜0.05), 后者表達顯著升高 (P ＜0.05),以芪歸益腎方組更明顯(P ＜0.05)。見圖3。

4 討論

在慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展過程中,血液高凝狀態(tài)發(fā)揮了重要負面作用,這一點已形成共識［11］。近年來還發(fā)現(xiàn),一些凝血、纖溶相關(guān)物質(zhì)通過激活信號通路來影響腎組織內(nèi)炎癥狀態(tài),并參與腎臟纖維化過程。

凝血酶調(diào)節(jié)蛋白(TM) 主要存在于血管內(nèi)皮表面,同時也存在于胸腔膜、心包膜、腹腔膜、蛛網(wǎng)膜等組織的間皮細胞表面,它是一種跨膜糖蛋白,由5 個結(jié)構(gòu)域組成,復(fù)雜結(jié)構(gòu)使其具有多種生理功能。凝血酶能激活蛋白質(zhì)C(PC),而TM 能使激活速度增加1 000 倍,活化的PC 能滅活Ⅴ因子和Ⅷ因子,減少腎血管內(nèi)微血栓形成的風險,從而逆轉(zhuǎn)凝血酶,還可與內(nèi)皮細胞蛋白質(zhì)C 受體(EPCR) 結(jié)合,通過影響下游信號分子來減輕腎臟炎性損傷［2-3］； 也可激活蛋白酶激活受體1(PAR1) 而誘導(dǎo)下游信號通路,從而發(fā)揮促炎作用［12］,并且調(diào)節(jié)蛋白和凝血酶結(jié)合時可阻止后者對PAR1 的激活,發(fā)揮抗炎作用［13］。

圖2 各組FN、TGF-β1、PAI-1、TM 表達（免疫組化，×400）Fig.2 Expressions of FN，TGF-β1，PAI-1 and TM in various groups（immunohistochemistry，×400）

腎臟是一個容易受到缺血性損傷的器官,因為人在應(yīng)急狀態(tài)下為保障心、腦重要器官的血液供應(yīng)而發(fā)生交感神經(jīng)興奮,對各器官血液供應(yīng)重新調(diào)配,腎臟供血急劇減少,并且慢性腎臟病在損傷修復(fù)的過程中,間質(zhì)中膠原纖維沉積增加,毛細血管數(shù)減少,故對缺血性損傷非常敏感［14］,而且組織內(nèi)缺氧及高壓力、高灌注造成對內(nèi)皮細胞的高切應(yīng)力,均會造成內(nèi)皮細胞損傷。受損的血管內(nèi)皮細胞合成內(nèi)皮素增加,而合成NO 減少,這種縮血管物質(zhì)與舒血管物質(zhì)之間的失衡導(dǎo)致微血管過度收縮,又進一步加重缺血性損傷,當內(nèi)皮細胞損傷時,TM 細胞外區(qū)域裂解為可溶性片段,Bao 等［15］發(fā)現(xiàn),在慢性腎臟病患者血漿中TM 裂解產(chǎn)物濃度明顯升高,并且與病情嚴重程度呈正相關(guān)。川芎有效成分川芎嗪、黃芪有效成分黃芪黃酮和黃芪多糖、川芎和當歸有效成分阿魏酸都已證實具有內(nèi)皮細胞保護作用［16-19］,本實驗發(fā)現(xiàn),芪歸益腎方組腎組織中TM 表達明顯低于假手術(shù)組,可能是輸尿管結(jié)扎造成梗阻后組織水腫造成腎內(nèi)血管受壓迫,引起缺血性損傷,腎組織內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇,造成血管內(nèi)皮受損,TM 裂解增加；較貝那普利組、川芎嗪組更能明顯增加TM 在腎組織中表達,可能是該方能更好地保護內(nèi)皮細胞,有利于增加TM 表達或保護其免受裂解,從而減輕腎組織內(nèi)炎癥反應(yīng)。

圖3 各組FN、TGF-β1、PAI-1、TM 表達比較（Western blot）Fig.3 Expressions of FN，TGF-β1，PAI-1 and TM in various groups（Western blot）

纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1) 可與組織型纖溶酶原激活劑(t-PA) 和尿激酶纖溶酶原激活劑(u-PA) 結(jié)合并使其滅活,tPA 主要由內(nèi)皮細胞合成,而u-PA 由內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、腎臟上皮細胞、某些腫瘤細胞合成,兩者均可激活纖溶酶原,使其轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶,故PAI-1 間接抑制了纖溶酶原激活,它主要由血管內(nèi)皮細胞和肝細胞合成,血小板中也可合成,在正常的小鼠、大鼠、人腎臟組織中PAI-1 表達很少,但隨著炎癥反應(yīng)發(fā)生,其在內(nèi)皮細胞、系膜細胞、小管上皮細胞中表達增加［4］。Oda 等通過UUO 模型發(fā)現(xiàn),PAI-1 基因敲除小鼠相比野生型小鼠腎間質(zhì)纖維化明顯減輕［20］；Zhang 等［21］報道,利用PAI-1 突變體抑制內(nèi)源性PAI-1 活性有利于延緩糖尿病腎病發(fā)生,并有足細胞保護作用；杜義斌等［22］利用PAI-1 基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn),PAI-1 可通過抑制纖溶酶、基質(zhì)金屬蛋白酶2 活性,減少細胞外基質(zhì)的降解,從而引起小鼠腎臟中細胞外基質(zhì)的沉積［5］；Song 等［23］通過動物實驗證實,具有健脾益腎,活血泄?jié)峁πУ闹兴幹苿┛赏ㄟ^抑制TGF-β1、PAI-1 表達,從而抑制細胞外基質(zhì)過度積聚,減輕腎臟纖維化程度,其中前者是腎臟纖維化最核心的調(diào)節(jié)因子,可通過上調(diào)后者表達來促進細胞外基質(zhì)聚積；本實驗也證實,TGF-β、PAI-1 表達具有一致性, 并且通過Western blot、免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組后者表達很少,而模型組、芪歸益腎方組、貝那普利組、川芎嗪組都有不同程度升高,可能是輸尿管結(jié)扎造成梗阻后,隨著腎組織內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇前者表達增加,使得后者表達也增加, 以芪歸益腎方組更明顯。

中醫(yī)認為,慢性腎臟病導(dǎo)致的腎臟纖維化屬“腎絡(luò)癥瘕”,其病機為本虛標實,因虛致實,即脾腎兩虛,血脈瘀阻［24］,治療時健脾益腎固然是關(guān)鍵,但活血通絡(luò)同樣重要,國醫(yī)大師張大寧提出補腎活血法則,在慢性腎小球腎炎、糖尿病腎病治療中取得了良好療效［25-26］。芪歸益腎方中金櫻子、芡實益腎健脾,為君藥；太子參、黃芪、白術(shù)益氣健脾,為臣藥；川芎、當歸、牛膝活血通絡(luò),白花蛇舌草清利下焦,蟬蛻搜風通絡(luò),共為佐藥；牛膝益腎通絡(luò)又引藥入腎經(jīng),甘草調(diào)和諸藥,同為使藥,全方共奏健脾益腎、活血通絡(luò)的功效,針對慢性腎臟病的治療既全面又有重點,具有良好的減輕蛋白尿、延緩腎臟纖維化作用。本實驗發(fā)現(xiàn),芪歸益腎方可通過增加腎臟組織中TM 表達或減少其代謝和減少PAI-1 表達,從而起到減輕腎組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)和纖維化的作用,明確該方可通過影響凝血、纖溶相關(guān)因子起到保護腎臟的作用。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活在腎臟纖維化過程中發(fā)揮重要作用,如血管緊張素Ⅱ通過上調(diào)NFκB、TGF-β1、結(jié)締組織生長因子(CTGF) 表達,促進腎臟炎癥和纖維化發(fā)生［27-28］,同時血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑能明顯減輕腎臟纖維化［29］,本實驗發(fā)現(xiàn),芪歸益腎方上述效果優(yōu)于西藥血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑——貝那普利。川芎嗪是從川芎中提取出的有效成分,具有降低血液黏度、改善微循環(huán)、抑制血小板聚集和血栓素A2 合成的作用,并可抑制自由基產(chǎn)生,提高內(nèi)源性抗氧化酶活性,還有抑制血管平滑肌細胞和成纖維細胞增生,抑制腎臟纖維化的作用［30-32］,本研究發(fā)現(xiàn),芪歸益腎方上述效果優(yōu)于川芎嗪。課題組前期基礎(chǔ)研究中報道,芪歸益腎方可通過對TGF-β1/Smads/PI3K 信號通路的影響來起到減輕腎臟纖維化的作用［7］,這也證明中藥方劑作為多物質(zhì)組成的集團具有多靶點治療作用,也是中醫(yī)藥治療腎臟病的優(yōu)勢,對將來中藥方劑的相關(guān)研究非常重要。