豆制品轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中不同DNA提取方法的比較

孫夢(mèng)夢(mèng)　黃歡歡　沈曉芳　龐月紅

摘要：高品質(zhì)的DNA是分子生物學(xué)研究的關(guān)鍵，大豆及豆制品中含有較多的蛋白質(zhì)、酚類、糖類和脂類物質(zhì)，從中提取高品質(zhì)的DNA比較困難。擬采用十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS）法、改良CTAB法、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）法、SDS-聚乙烯吡咯烷酮（簡稱SDS-PVP）法和TIANGEN試劑盒法對(duì)大豆MON 89788、小黃豆、豆腐及大豆油中的DNA進(jìn)行提取，對(duì)試驗(yàn)過程中的蛋白酶K、RNA酶A的濃度進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)DNA濃度及純度進(jìn)行綜合分析。結(jié)果表明，對(duì)于大豆MON 89788、小黃豆和豆腐，用SDS法提取的DNA的D260 nm/D280 nm值在1.8左右，DNA產(chǎn)量最高，用改良CTAB法提取的DNA的D260 nm/D280 nm值在1.8左右，用TIANGEN試劑盒法提取的DNA的D260 nm/D280 nm值在1.75左右，2種方法的DNA產(chǎn)量均比SDS法低，而用 SDS-PVP 法與CTAB法提取的DNA含有較多雜質(zhì)。綜合分析可知，大豆油的最佳DNA提取方法為改良CTAB法。

關(guān)鍵詞：大豆MON 89788;豆制品;DNA提取;瓊脂糖凝膠電泳

中圖分類號(hào)： S188? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）04-0047-04

大豆及豆制品是全球食用油及植物蛋白的重要來源，為了提高大豆的產(chǎn)量，滿足人們對(duì)大豆的需求量，科研人員采用基因工程與分子輔助育種方法，培育了一些優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和抗逆的轉(zhuǎn)基因大豆品種[1]。據(jù)報(bào)道，我國的大豆需求量從1990年的1 100萬t增加到2015年的9 300萬t，但是我國的大豆總產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足國內(nèi)需求，從1996年起，我國成為大豆的凈進(jìn)口國，進(jìn)口量從當(dāng)年的111萬t持續(xù)增加到2015年的8 169萬t[2]。目前我國進(jìn)口的大豆主要來自美國、巴西、阿根廷這3個(gè)國家，而這3個(gè)國家出口的大豆基本上為轉(zhuǎn)基因大豆[3]。由于公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的食用安全性和生態(tài)安全性認(rèn)識(shí)存在爭議，部分國家和地區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物提出了標(biāo)簽化管理的要求。為保障廣大消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)，建立準(zhǔn)確、快速的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法至關(guān)重要[4-5]?；驒z測(cè)技術(shù)，尤其是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）[6-9]，已被廣泛用于食品生物安全檢測(cè)等領(lǐng)域。然而，基因組DNA的提取是基因檢測(cè)技術(shù)研究的基礎(chǔ)[10]，由于大豆及豆制品中含有較多的多糖、酚類物質(zhì)，在提取DNA時(shí)首先要考慮如何去除多糖、多酚等干擾PCR效果的物質(zhì)，從而在某種程度上增加了大豆DNA提取的困難程度[11-12]。因此，如何從大豆及豆制品中獲得高質(zhì)量的DNA是后續(xù)食品檢測(cè)成功與否的關(guān)鍵[13-15]。

本試驗(yàn)采用十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS）法、改良十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）法、CTAB法[16-18]、SDS-聚乙烯吡咯烷酮（簡稱SDS-PVP）法及TIANGEN試劑盒法提取大豆MON 89788、小黃豆、豆腐、大豆油中的DNA，通過比較濃度、純度等指標(biāo)，篩選出適合大豆及豆制品DNA提取的方法，以期為后續(xù)的分子生物學(xué)分析及標(biāo)簽化管理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本試驗(yàn)于2016年11月至2017年5月在江南大學(xué)食品學(xué)院食品質(zhì)量與安全中心進(jìn)行。

1.1 材料與試劑

小黃豆、豆腐、大豆油均購于江蘇省內(nèi)的歐尚超市;MON 89788大豆為轉(zhuǎn)基因大豆品種，購于AOAC（美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì)）。

CTAB提取緩沖液（pH值為8.0）、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，簡稱PBS）、SDS提取/裂解緩沖液、TE緩沖液（pH值為8.0）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，簡稱EDTA）溶液（pH值為 8.0，0.5 mol/L）、改良CTAB提取緩沖液，均由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供;核酸序列和marker，購于生工生物工程（上海）股份有限公司;TIANGEN試劑盒，購于北京TIANGEN公司;蛋白酶K、RNA酶A，購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800紫外分光光度計(jì)，日本島津公司;T 100TM PCR儀，美國Bio-Rad公司;Tanon 6600全自動(dòng)凝膠成像儀，上海天能公司;高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司;TGL-16G高速離心機(jī)，上海安亭公司;SHA-B恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司。

1.3 DNA提取方法

根據(jù)所用方法配制相應(yīng)的抽提緩沖液，其中SDS法、改良CTAB法、CTAB法、SDS-PVP法參照農(nóng)業(yè)部1485號(hào)公告-4-2010《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)DNA提取和純化》，TIANGEN試劑盒按照說明書進(jìn)行試驗(yàn)操作，將提取出的DNA放入冰箱，待后續(xù)檢測(cè)使用。

1.4 酶的優(yōu)化

以大豆MON 89788為樣品，對(duì)不同DNA提取方法中蛋白酶K、RNA酶A的濃度進(jìn)行優(yōu)化，TIANGEN試劑盒按說明書進(jìn)行操作不作此優(yōu)化，用紫外分光光度法檢測(cè)DNA的濃度和純度，得出蛋白酶K、RNA酶A的最佳濃度。

1.5 DNA的濃度和純度

用紫外分光光度法鑒定DNA的濃度、純度：取10 μL DNA提取液稀釋300倍，測(cè)定試驗(yàn)樣品在260、280 nm下的D值，用D260 nm/D280 nm值判斷各樣品中的DNA純度，并計(jì)算DNA的濃度。DNA濃度計(jì)算公式如下：

DNA質(zhì)量濃度（ng/μL）=50 ng/μL×D260 nm×稀釋倍數(shù)。

根據(jù)SN/T 1195—2003《大豆中轉(zhuǎn)基因成分的定性PCR檢測(cè)方法》，選擇不同提取方法及不同樣品的基因組DNA對(duì)大豆的Lectin基因進(jìn)行核酸定性PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min，4 ℃保存。Lectin基因的PCR引物信息見表1。

吸取5 μL經(jīng)PCR擴(kuò)增的DNA提取液，與2 μL上樣緩沖液充分混合，在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間為 40 min，電壓為100 V，電泳結(jié)果在紫外燈下進(jìn)行觀察、拍照。吸取5 μL稀釋100倍的DNA提取原液，重復(fù)上述步驟。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶K、RNA酶A的濃度優(yōu)化

大豆及豆制品中的蛋白質(zhì)含量豐富，蛋白酶K具有消化包圍靶DNA的蛋白質(zhì)的作用，可以使DNA更好地被釋放出來，所以本試驗(yàn)優(yōu)化了蛋白酶K的添加濃度。如圖1所示，不同濃度的蛋白酶K對(duì)提取的DNA純度有較大影響，在不添加蛋白酶K或蛋白酶K濃度為5 mg/mL時(shí)，D260 nm/D280 nm值在1.7以下，說明蛋白質(zhì)污染嚴(yán)重;當(dāng)?shù)鞍酌窴濃度越來越大時(shí)，D260 nm/D280 nm值越來越接近1.8;當(dāng)?shù)鞍酌窴的濃度超過 20 mg/mL 后，D260 nm/D280 nm值再次降至1.7以下，說明又存在蛋白質(zhì)污染。出現(xiàn)這些結(jié)果的原因，是由于蛋白酶K本身也是蛋白質(zhì)，如果加入濃度過高，也會(huì)造成蛋白質(zhì)污染。所以，本試驗(yàn)選擇15 mg/mL為最佳蛋白酶K濃度。

在DNA的提取過程中如果有RNA污染，會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果，RNA酶A對(duì)RNA有水解作用，本試驗(yàn)優(yōu)化了RNA酶A的添加濃度。如圖2所示，當(dāng)不添加RNA酶A或RNA酶A濃度≤4 mg/mL時(shí)，D260 nm/D280 nm值在1.9以上，說明RNA污染嚴(yán)重;隨著RNA酶A的濃度增大，D260 nm/D280 nm值越接近1.8; RNA酶A濃度在達(dá)到8 mg/mL之后，隨著RNA酶A濃

度的增大，D260 nm/D280 nm值趨于穩(wěn)定。所以，本試驗(yàn)選擇 8 mg/mL 為最佳RNA酶A濃度。

2.2 5種方法提取不同樣品DNA純度、濃度的鑒定

用SDS法、改良CTAB法、CTAB法、SDS-PVP法和TIANGEN試劑盒法提取大豆MON 89788、小黃豆、豆腐以及大豆油中DNA的純度如圖3所示。當(dāng)D260 nm/D280 nm在1.7以下時(shí)，表示有蛋白質(zhì)污染，當(dāng)D260 nm/D280 nm在1.9以上時(shí)，表示有RNA污染，D260 nm/D280 nm在1.8左右時(shí)，表示得到高純度的DNA[19]。對(duì)大豆MON 89788及小黃豆樣品采用SDS法、改良CTAB法提取的DNA的D260 nm/D280 nm值在1.8左右， 表

明用SDS法、改良CTAB法提取大豆DNA的質(zhì)量好，純度較高。豆腐屬于深加工產(chǎn)品，在加工過程中經(jīng)過熱處理并加入不同物質(zhì)等，會(huì)使DNA發(fā)生不同程度的降解，所以在5種方法下，DNA的提取純度均有所下降，用SDS法提取的DNA的D260 nm/D280 nm值為1.8，其他方法的D260 nm/D280 nm值為1.7左右，表明SDS法的提取效果最好。大豆油經(jīng)過較為復(fù)雜的精煉過程，其中的DNA在一定程度上損失了，使得大豆油DNA的提取較困難，因此大豆油DNA最適合用改良CTAB法提取。

由圖4可以看出，用5種方法提取大豆MON 89788、小黃豆、豆腐DNA濃度的結(jié)果顯示，SDS法提取的DNA濃度明顯優(yōu)于其他方法，SDS-PVP法的效果最差。這主要由于SDS是一種陰離子去污劑，在高溫條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析、蛋白變性，同時(shí)，SDS會(huì)與蛋白質(zhì)、多糖結(jié)合成復(fù)合物，釋放出核酸，使得DNA得率較高，通過三氯甲烷及酚溶液抽提、鹽溶液濃度增加去除雜質(zhì)，能夠得到高質(zhì)量的DNA。PVP是高分子表面活性劑，PVP的加入增加了提取反應(yīng)體系中的黏稠性，部分DNA被吸附從而使提取的DNA含量降低。5種方法提取的豆腐DNA濃度明顯比大豆MON 89788、小黃豆樣品的低，這是由于豆腐在深加工過程中，部分DNA被破壞而損失。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

選擇大豆Lectin基因驗(yàn)證所提取的DNA是否能夠滿足后續(xù)PCR檢測(cè)的需要。對(duì)不同樣品的不同提取方法提取得到的DNA進(jìn)行Lectin基因PCR擴(kuò)增，如果提取得到的DNA中有蛋白質(zhì)、多糖、RNA等雜質(zhì)污染，這些雜質(zhì)就會(huì)遏制PCR反應(yīng)，出現(xiàn)假陰性結(jié)果[20]。圖5為其中最佳的2種方法（SDS法和改良CTAB法）的PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果，可以看出，模板DNA都擴(kuò)增正常，說明所提取的DNA沒有被污染，純度較高。由于不同試驗(yàn)樣品的DNA都能夠擴(kuò)增出比較鮮明、條帶

大小約為118 bp的DNA條帶，與所需終產(chǎn)物的片段大小一樣，結(jié)論可靠，因此可知，SDS法和改良CTAB法可以用作DNA的提取方法。

由圖6的2種方法（SDS法和改良CTAB法）對(duì)不同樣品的基因組DNA完整性凝膠電泳結(jié)果可以看出，使用SDS法、改良CTAB法都能得到DNA條帶，用SDS法提取的大豆MON 89788、小黃豆和豆腐的基因組DNA條帶更清晰，更完整。由于大豆油的提取效果較差，因此基因組DNA條帶不清晰。此外，1號(hào)點(diǎn)膠孔處亮度較高，表明有少許蛋白質(zhì)污染。綜上可以看出，SDS法的提取效果最佳。

3 總結(jié)與展望

本試驗(yàn)以大豆MON 89788、小黃豆、豆腐、大豆油為樣品，研究SDS法、改良CTAB法、CTAB法、SDS-PVP法及TIANGEN試劑盒法提取DNA的效果，旨在選出簡單、快捷、高品質(zhì)的DNA提取方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于大豆及豆腐樣品，SDS法提取DNA的濃度及純度最佳，改良CTAB法和TIANGEN試劑盒法的效果次之;如果對(duì)DNA純度和濃度要求不高且需要快速提取，可以考慮TIANGEN試劑盒法;對(duì)于大豆油DNA提取的最佳方法為改良CTAB法。在DNA提取過程中應(yīng)該盡量簡化操作步驟，這樣可以減少對(duì)基因組的損傷和操作過程中污染的可能性。目前，適合大豆油DNA提取的方法較少且提取的DNA產(chǎn)量不高，有待于進(jìn)一步探索更有效的DNA提取方法。

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