CXC趨化因子受體4在甲狀腺癌組織中的表達(dá)水平及與CD163的相關(guān)性*

任浩棠， 吳澤建， 李瑞平， 陳實(shí)， 張玉奇， 李小悅△

1東莞市人民醫(yī)院普外科(廣東東莞 523059)； 2中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院胃腸外科(廣東廣州 510655)； 3桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院急診科(廣西桂林 541199)

甲狀腺是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，根據(jù)甲狀腺癌的病理可以分為4種，其中未分化癌是最具毒性和侵襲性的癌癥在人類(lèi)實(shí)體癌癥，顯示極端生存期短[1]。中位生存時(shí)間2.5～6個(gè)月，5年存活率為0～14%[2-3]。不少甲狀腺癌患者在診斷前已經(jīng)存在具有轉(zhuǎn)移性病變，最常見(jiàn)于肺部或骨轉(zhuǎn)移[4]。目前對(duì)于甲狀腺癌除了手術(shù)治療以外，還包括采用放化療和內(nèi)分泌治療[5]，但如何進(jìn)一步改善甲狀腺癌患者的預(yù)后仍然是目前臨床研究難點(diǎn)。最近的研究[6]表明，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度在腫瘤微環(huán)境中顯著增高，特別是M2巨噬細(xì)胞，其高密度直接影響了多種腫瘤的臨床預(yù)后。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages，TAMs)是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境中的主要類(lèi)型的基質(zhì)細(xì)胞[7]。TAMs可以分為兩種不同的極化狀態(tài)，包括具有抗腫瘤效果的M1巨噬細(xì)胞，和發(fā)揮腫瘤免疫抑制劑促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的M2巨噬細(xì)胞。TAMs已經(jīng)被表明其對(duì)患者的臨床預(yù)后具有重要影響的標(biāo)記物[8]。研究[9]表明，癌組織中高密度的TAMs導(dǎo)致了肝癌、腎癌、甲狀腺癌等多種腫瘤的不良預(yù)后。而趨化因子受體是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞分泌蛋白的重要因子，也參與腫瘤血管生成和腫瘤免疫相關(guān)細(xì)胞的調(diào)控[10]。CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)是癌細(xì)胞最重要的趨化因子受體之一。既往研究[11]顯示，CXCR4在卵巢上皮癌細(xì)胞中表達(dá)并且在腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移發(fā)揮關(guān)鍵作用，表明CXCR4過(guò)表達(dá)是促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移或侵襲行為的重要因素。此外，也有研究[12]表明CXCR4已被顯示通過(guò)促進(jìn)構(gòu)建腫瘤微環(huán)境發(fā)揮巨噬細(xì)胞募集的作用。但對(duì)于CXCR4在甲狀腺癌中與M2巨噬細(xì)胞的關(guān)系仍值得進(jìn)一步探討，本研究旨在分析CXCR4在甲狀腺癌組織表達(dá)水平及與CD163 TAMs的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年4月至2016年6月于我院行手術(shù)治療的甲狀腺癌患者的73例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理確診原發(fā)性甲狀腺癌；(2)初次手術(shù)治療；(3)病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)曾使用核素治療的患者；(2)合并其他甲狀腺疾病；(3)失去隨訪(fǎng)的患者。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。其中73例患者中，男26例，女47例，年齡31～76歲，平均(46.3±11.2)歲。所有腫瘤患者TNM分期為Ⅰ～Ⅳ期，其中Ⅰ～Ⅱ期為35例，Ⅲ～Ⅳ期為38例。

1.2 免疫組化檢測(cè) 所有組織在手術(shù)切除后采用石蠟包埋，同一患者采用同一塊組織取2張切片，厚度為5 μm，切片經(jīng)脫蠟、梯度水化后，經(jīng)含10%蔗糖蒸餾水中進(jìn)行浸泡過(guò)夜，采用檸檬酸鹽緩沖液中煮沸30 min進(jìn)行抗原修復(fù)，經(jīng)PBS漂洗后，采用正常山羊血清進(jìn)行封閉，一抗在4℃下進(jìn)行過(guò)夜孵育。具體使用抗體為CD163，兔單克隆抗體(Cell Signaling Technology，#93498，美國(guó)，稀釋倍數(shù)1∶500)；CXCR4(Cell Signaling Technology，#97680，美國(guó)，稀釋倍數(shù)1∶800)，孵育完畢經(jīng)PBS中洗滌3次(5 min/次)后，與生物素標(biāo)記的二抗37℃條件下孵育1 h,最后在DAB室溫反應(yīng)后蘇木精復(fù)染，在顯微鏡下評(píng)估CXCR4和CD163的表達(dá)水平。

1.3 免疫組化評(píng)估方法 每個(gè)切片隨機(jī)取5個(gè)視野(×200)進(jìn)行評(píng)估，取平均數(shù)，其中CXCR4的評(píng)估采用半定量法評(píng)估，通過(guò)染色強(qiáng)度×染色的細(xì)胞所占面積得到的復(fù)合表達(dá)評(píng)分(composite expression score，CES)進(jìn)行評(píng)估。其中染色強(qiáng)度為0～3分，染色細(xì)胞所占的面積分為<5%，5%～25%，26%～50%，51%～75%和>75%分別評(píng)為0～4分，總分為0～12分，CES分?jǐn)?shù)越高表明CXCR4的表達(dá)水平越高，其中CES<5分為低表達(dá)，CES≥5分為高表達(dá)。評(píng)估CD163 TAMs，通過(guò)計(jì)算單個(gè)高倍鏡下(×200)中腫瘤組織和基質(zhì)組織中總的CD163陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)比每個(gè)視野中的總細(xì)胞數(shù)得到CD163巨噬細(xì)胞的密度，具體圖像計(jì)數(shù)采用image J軟件進(jìn)行，最后每例標(biāo)本取5個(gè)視野的平均值。

1.4 臨床數(shù)據(jù)收集 記錄患者的性別、年齡、患者的TNM分期，是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。每例患者術(shù)后每3～6個(gè)月返院復(fù)診1次，記錄所有患者的隨訪(fǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺癌組織中CXCR4和CD163 TAMs的表達(dá)情況 73例甲狀腺癌組織中CXCR4的平均表達(dá)CES評(píng)分為4.27±2.10，其中高表達(dá)的有27例，低表達(dá)的有46例；而CD163 TAMs平均密度為(5.92±4.33)%，CXCR4和CD163 TAMs在甲狀腺癌組織中的表達(dá)情況見(jiàn)圖1。

A：CXCR4高表達(dá)；B：CXCR4低表達(dá)；C：CD163 TAMs高密度；D：CD163 TAMs低密度

圖1甲狀腺癌組織中CXCR4和CD163TAMs的表達(dá)情況(免疫組化，×200)

2.2 甲狀腺癌組織CXCR4表達(dá)和CD163巨噬細(xì)胞密度與臨床特征的關(guān)系 CXCR4表達(dá)和CD163巨噬細(xì)胞密度在不同性別、不同年齡患者中的表達(dá)情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在不同臨床腫瘤分期、腫瘤類(lèi)型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中，Ⅲ～Ⅴ期、未分化癌和存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的CXCR4表達(dá)和CD163巨噬細(xì)胞密度顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

臨床特征例數(shù)CXCR4(CES)P值CD163巨噬細(xì)胞密度(%)P值性別0.1150.444 男264.78±2.265.94±3.95 女473.99±1.985.82±5.09年齡0.5460.719 ≤45歲334.08±2.475.55±4.17 >45歲403.42±1.776.18±4.53臨床分期0.0050.037 Ⅰ～Ⅱ期353.51±2.264.39±2.72 Ⅲ～Ⅴ期384.90±1.687.29±5.09腫瘤類(lèi)型<0.001<0.001 分化癌513.55±1.903.85±2.79 未分化癌225.80±1.6110.65±3.54淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.0110.012 是245.16±2.167.98±5.23 否493.77±1.904.73±3.42

2.3 甲狀腺癌組織CXCR4表達(dá)和CD163巨噬細(xì)胞密度的相關(guān)性分析 73例甲狀腺癌組織中CXCR4表達(dá)CES評(píng)分和CD163巨噬細(xì)胞密度呈正相關(guān)(r=0.58,P<0.001)，見(jiàn)圖2。

圖2 甲狀腺癌組織中CXCR4表達(dá)和CD163巨噬細(xì)胞密度的散點(diǎn)圖

2.4 甲狀腺癌組織CXCR4表達(dá)和臨床預(yù)后的關(guān)系 73例甲狀腺癌患者隨訪(fǎng)時(shí)間為3～47個(gè)月，中位隨訪(fǎng)時(shí)間為34個(gè)月， Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)結(jié)果顯示CXCR4高表達(dá)患者(n=27)的總體生存率顯著低于CXCR4低表達(dá)的患者(n=46)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=3.419，95CI%：1.352～8.646，P=0.009 4)。見(jiàn)圖3。

圖3 甲狀腺癌組織CXCR4表達(dá)水平與總體生存率的關(guān)系

3 討論

本研究重點(diǎn)探討了甲狀腺癌組織CXCR4表達(dá)和CD163巨噬細(xì)胞密度與臨床特征的關(guān)系，以及CXCR4表達(dá)和CD163巨噬細(xì)胞密度的相關(guān)性。結(jié)果顯示腫瘤分組為Ⅲ～Ⅴ期、腫瘤類(lèi)型為未分化癌和存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌組織CXCR4表達(dá)和CD163巨噬細(xì)胞密度顯著增高，且CXCR4表達(dá)水平與患者的臨床預(yù)后具有密切的關(guān)系。顯示了CXCR4表達(dá)水平和CD163巨噬細(xì)胞均在甲狀腺癌的病情進(jìn)展中具有重要作用，且兩者具有密切的關(guān)系。

既往研究[13]已經(jīng)顯示TAM中的M2型、即CD163陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞在腫瘤組織中的密度與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。高密度的TAMs多存在于晚期和預(yù)后較差的腫瘤組織中，如乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌和膀胱癌[14-15]。特別在甲狀腺癌中，Ryder等[16]研究表明晚期甲狀腺癌組織中TAMs的密度顯著增高，并表明TAMs的高密度與腫瘤病情進(jìn)展具有密切的關(guān)系。進(jìn)一步研究[17]發(fā)現(xiàn)TAMs的總體密度在乳頭狀甲狀腺癌中明顯增高，且癌組織中的TAMs密度顯著高于良性病變，TAMs密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期也顯著相關(guān)。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果相一致，而本研究中的腫瘤分型中，未分化癌患者的TAMs密度顯著高于分化型的甲狀腺癌，這可能與未分化癌中惡性程度更高有關(guān)，未分化癌患者是惡性程度最高的腫瘤之一，研究[18]顯示其生存率均顯著低于分化型甲狀腺癌。M2 型TAM在腫瘤組織發(fā)揮抑制免疫應(yīng)答的作用，目前根據(jù)TAM的性質(zhì)已經(jīng)開(kāi)發(fā)了潛在的治療策略和靶點(diǎn)[19]，但TAM在甲狀腺癌中發(fā)揮作用的具體的機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。

CXCR4是一種對(duì)基質(zhì)衍生因子-1(SDF-1也稱(chēng)為CXCL12)特異的α-趨化因子受體，該分子具有對(duì)淋巴細(xì)胞的強(qiáng)烈趨化活性[20]。本研究顯示了CXCR4在晚期、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未分化甲狀腺癌中的表達(dá)更高，表明了CXCR4對(duì)甲狀腺癌的病情進(jìn)展中發(fā)揮了重要調(diào)控作用。研究結(jié)果也顯示了高表達(dá)CXCR4與M2 型TAM的密度具有顯著的正相關(guān)。既往研究[21]顯示CXCR4陽(yáng)性的癌細(xì)胞中存在更高濃度的趨化因子12(CXCL12)，這些CXCL12豐富的環(huán)境增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞募集浸潤(rùn)和M2-巨噬細(xì)胞極化。這也可能是CXCR4與CD163 TAMs密度顯著正相關(guān)的潛在機(jī)制，但本研究中并未進(jìn)一步探討CXCL12在組織中的表達(dá)水平，因此，對(duì)于CXCR4調(diào)控CD163 TAMs募集和極化的基質(zhì)仍需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，甲狀腺癌中CXCR4的表達(dá)水平及CD163 TAMs均密度與腫瘤分期、腫瘤類(lèi)型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有密切的關(guān)系，CXCR4的表達(dá)水平及CD163 TAMs密度呈正相關(guān)，且高CXCR4表達(dá)的甲狀腺癌患者預(yù)后不良。