蛹蟲草玉米肽功能性飲料的研制及其抗氧化活性研究

李冠龍，鄭喜群，劉曉蘭，鄧永平

1(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾，161006)2(黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾，161006)3(黑龍江八一農(nóng)墾大學 食品學院，黑龍江 大慶，163319)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)又稱北冬蟲夏草，屬子囊菌亞門、核菌綱、球殼目、麥角菌科、蟲草屬，與冬蟲夏草同屬異種[1]。蛹蟲草的營養(yǎng)價值與冬蟲夏草相似，含有蟲草素、蟲草多糖、蟲草酸等多種生物活性物質(zhì)，在抗菌、抗癌、增強人體免疫力等方面有重要作用[2]。目前，以蛹蟲草為原料的產(chǎn)品主要包括化妝品、藥品和保健食品等[3]，而蛹蟲草飲料在市場上卻幾乎沒有。

玉米肽是以玉米蛋白粉為原料，通過蛋白酶水解得到的具有生物活性的小分子肽。玉米肽在很大的pH范圍內(nèi)能徹底溶解于水，對熱穩(wěn)定，安全可靠，無毒副作用，是一種天然的食品蛋白[4]。玉米肽富含多種人體所必需的氨基酸[5]，并且易于人體吸收。特殊的氨基酸組成和連接方式賦予玉米肽多種生物活性，如抗疲勞、促進乙醇代謝、抗氧化、抗癌等[6-8]。

市面上大多數(shù)的飲料都是碳酸和果汁類，具有保健功能的飲料較少，正是由于市場上功能飲料的匱乏，并且隨著人們越來越注重生活水平和自身身體素質(zhì)的提高，所以功能飲料擁有廣闊的發(fā)展前景。賈俊杰等以蛹蟲草速溶粉為原料，研究了其對小鼠腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)蛹蟲草固體飲料對于抗生素干擾引起的腸道菌群失調(diào)具有較好的修復作用，可調(diào)節(jié)并保持腸道微生態(tài)菌群的平衡[9]。樸美子等研究了蛹蟲草黃豆粉發(fā)酵飲料對小鼠免疫和降血脂功能的影響，發(fā)現(xiàn)蛹蟲草黃豆粉發(fā)酵飲料有較好的提高免疫力和降血脂的功效[10]。蛹蟲草作為藥食同源的大型真菌，既可滿足人們對食品風味的需求，長期食用又可預防高血壓、腦血栓等高危疾病。因此，本文以蛹蟲草和玉米肽為主要原料，通過正交試驗確定最佳配比和體外抗氧化活性，研制具有抗氧化、降血壓、提高免疫力、降低血栓傾向等多種功效的功能性飲料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蛹蟲草、玫瑰花干、蜂蜜，均為市售；玉米肽，購自齊齊哈爾易翔公司；乙基麥芽酚、檸檬酸、檸檬酸鈉和VC，均為國產(chǎn)食品級產(chǎn)品；無水乙醇、DPPH、FeSO4、H2O2等均為分析純試劑，購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平(BSA124S)和酸度計(PB-10)，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器，常州榮華儀器制造有限公司；CR21G高速冷凍離心機和Primaide高效液相色譜儀，日立公司；TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；粉碎機，山東金普分析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 蛹蟲草的浸提條件的確定

設定溫度分別為30、40、50、60和70 ℃，浸提時間分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4 h，通過苯酚硫酸法對浸提液蟲草多糖含量進行測定，以蟲草多糖含量為指標確定蛹蟲草的最佳浸提條件。

1.3.3 蛹蟲草浸提液與水或玫瑰花水的比例確定

在玉米肽添加量為10 g/L、檸檬酸添加量為0.15 g/L、 乙基麥芽酚添加量為1 g/L、蜂蜜添加量為80 g/L的條件下，設定蛹蟲草浸提液與水或玫瑰花水(取1 g玫瑰花加入500 mL水在80 ℃下浸提30 min) 的體積比分別為1∶1、2∶1、3∶1，利用感官評定方法，確定蛹蟲草浸提液與水或玫瑰花水的比例。

1.3.4 飲料配方單因素條件優(yōu)化

設定蛹蟲草浸提液與玫瑰花水的比例為2∶1，以飲料的感官評分為指標，分別考察玉米肽(5、10、15、20、25 g/L)、乙基麥芽酚(0.5、1、1.5、2 g/L)、蜂蜜(60、70、80、90 g/L)和檸檬酸(0.1、0.15、0.2、0.25 g/L)添加量對產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響。

1.3.5 最佳配方的確定

選取蛹蟲草浸提液與玫瑰花水的比例、玉米肽的添加量、蜂蜜添加量和檸檬酸添加量為因素，進行L9(34)正交試驗，確定各參數(shù)的最佳配比。因素與水平見表1。

表1 飲料配方正交試驗因素與水平表Table 1 Orthogonal test factors and levels of beverage formula

1.3.6 感官評價法

挑選 20 人對飲料進行感官評定，以產(chǎn)品的色澤、口感、氣味及組織狀態(tài)4個因素作為感官評價指標進行打分，總分為100分，其中口感、氣味、色澤和組織狀態(tài)分別占25%、20%、15%和10%。評分標準如表2所示。

表2 感官評價表Table 2 Sensory evaluation table

1.3.7 理化指標檢測

血纖維蛋白平板法測定纖溶酶活力[11]；苯酚硫酸法測定飲料中總糖的含量[12]；高效液相色譜法測定飲料中蟲草素含量[13]。

1.3.8 抗氧化活性的測定

將蛹蟲草飲料成品稀釋10倍，進行抗氧化活性測定,以Vc作為對照。

(1)DPPH·清除率的測定

DPPH·清除率的測定參考文獻[14] 的方法，清除率的計算公式如式(1)：

(1)

式中：Ai，樣品吸光度值；Aj，樣品與無水乙醇的吸光度值；A0，DPPH無水乙醇的吸光值。

(2)·OH清除率的測定

·OH清除率的測定參考文獻[15]的方法，清除率的計算公式如式(2)：

(2)

式中:Ai，樣品吸光度值；Aj，無水楊酸的吸光度值；A0，空白對照的吸光度值。

(3)還原力的測定

還原力的測定參考文獻[16] 的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草浸提條件的確定

2.1.1 溫度的優(yōu)化

在料液比為1∶50(g∶mL)，浸提時間為2 h時，用苯酚硫酸法分別測定在30、40、50、60和70 ℃下的浸提液蟲草多糖含量，結(jié)果如圖1所示。

圖1 浸提溫度對蛹蟲草多糖含量的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on Cordyceps militaris polysaccharide content

由圖1可知，隨著溫度的升高，分子熱運動加快，多糖含量也隨之增加，50 ℃之前，溫度較低，多糖含量增加的比較緩慢。溫度升高，對細胞的破壞作用加大，有利于多糖的浸出。當浸提溫度為60 ℃時，多糖提取量為20 mg/mL，繼續(xù)溫度升高，多糖含量有所下降，故浸提溫度60 ℃為宜。

2.1.2 浸提時間的優(yōu)化

在料液比為1∶50(g∶mL)，溫度為60 ℃，用苯酚硫酸法測定30、60、90、120、150、180、210和240 min浸提液蛹蟲草多糖含量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取時間對蟲草多糖含量的影響Fig.2 Effect of extraction time on Cordyeps militaris polysaccharide content

由圖2可知，浸提時間為30～120 min時，蟲草多糖含量呈上升趨勢，120 min時蟲草多糖含量最高為11.8 mg/mL，120 min后蟲草多糖含量隨時間的升高略有下降并逐漸趨于平緩，可能是由于提取時間過長，多糖發(fā)生了轉(zhuǎn)化，含量降低。故浸提時間120 min為宜。

2.2 飲料配方的確定

2.2.1 蛹蟲草浸提液與水或玫瑰花水的比例的確定

蛹蟲草浸提液與水或玫瑰花水的比例試驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 蛹蟲草浸提液與水或玫瑰花水的比例對飲料感官評定的影響Fig.3 Effect of proportion of Cordyceps militaris extract and water or rose water on beverage sensory evaluation

由圖3可知蛹蟲草浸提液與水或玫瑰花水的體積比為2∶1時感官評定均呈現(xiàn)最高值，而玫瑰花水的感官評價明顯優(yōu)于水，真菌子實體在浸提的過程中會有一些特殊的氣味，這些氣味會影響飲料成品的氣味，添加一定量的玫瑰花水后，玫瑰花水的香味可以掩蓋這些特殊的氣味，使飲料的氣味得到改善，若是玫瑰花水添加太多則會導致蛹蟲草味道被掩蓋，故選取蛹蟲草浸提液與玫瑰花水為2∶1的比例。

2.2.2 玉米肽添加量的確定

玉米肽是以玉米蛋白為原料，利用蛋白酶水解玉米蛋白獲得的產(chǎn)物，不同的蛋白酶和水解條件獲得的玉米肽具有不同的生物活性[17]。玉米肽中富含多種人體必需氨基酸，特殊的氨基酸組成和連接方式賦予玉米肽多種生物活性，如抗疲勞、促進乙醇代謝、抗氧化、降血壓等[5-8]，玉米肽添加量試驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 玉米肽添加量對飲料感官評定的影響Fig.4 Effect of corn peptides on beverage sensory evaluation

由圖4可知，隨著玉米肽添加量的逐漸增加，感官評分出現(xiàn)先增加后降低的趨勢。玉米肽是玉米蛋白通過蛋白酶水解獲的產(chǎn)物，在水解過程中，玉米蛋白中大量的疏水性氨基酸暴露，導致玉米肽具有一定的苦味，添加到飲料中，會使飲料的口感和氣味有所改變。玉米肽添加量在10 g/L時，感官評定的分數(shù)最高，若玉米肽添加量大，苦味也就隨之增大，若玉米肽添加量過少，則飲料的功能性有所降低。故選取玉米肽為10 g/L的添加量。

2.2.3 乙基麥芽酚添加量的確定

乙基麥芽酚是一種安全無毒、用途廣、效果好、用量少的理想食品添加劑，是煙草、食品、飲料、香精、果酒等良好的香味增效劑，常常添加到飲料中，起到掩蔽劑的作用，對食品的香味改善和增強具有顯著效果，且能延長食品儲存期。由于玉米肽的添加，引入了一定的苦味，所以通過添加一定量的乙基麥芽酚來掩蓋苦味。乙基麥芽酚添加量結(jié)果如圖5所示。

圖5 乙基麥芽酚的添加量對飲料感官評定的影響Fig.5 Effect of ethyl maltol content on beverage sensory evaluation

由圖5可知，乙基麥芽酚的添加量在1.5 g/L時感官評定的分數(shù)最高，乙基麥芽酚添加量過少不能將玉米肽的苦味適度掩蓋；若乙基麥芽酚添加過多，會使飲料中充滿乙基麥芽酚的味道，口感不適，故選取乙基麥芽酚為1.5 g/L的添加量。

2.2.4 蜂蜜添加量的確定

蜂蜜除了富含糖類物質(zhì)外，還含有少量的維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機酸及多種人體必需的微量元素[18]。此外，蜂蜜中還含有多種酶類物質(zhì)，主要包含葡萄糖氧化酶、淀粉酶及轉(zhuǎn)化酶等，其中轉(zhuǎn)化酶可將蜂蜜中蔗糖轉(zhuǎn)化為具有旋光性的單糖，即α-果糖和α-葡萄糖[19]。蜂蜜作為甜味劑在賦予飲料甜味的同時，還引入了很多的營養(yǎng)物質(zhì)，使飲料的營養(yǎng)價值進一步提升。蜂蜜添加量試驗結(jié)果如圖6所示。

圖6 蜂蜜添加量對飲料感官評定的影響Fig.6 Effect of honey content on beverage sensory evaluation

由圖6可知，甜味由淡變甜到過甜，感官評分先升高后降低，因此蜂蜜添加量80 g/L為宜。蜂蜜的甜度較大，其用量會直接影響飲料的口感，用量少則飲料沒有甜味或甜味過低，用量多甜味過高，會掩蓋飲料的其他風味。

2.2.5 檸檬酸添加量的確定

檸檬酸是一種食品添加劑，常常作為酸味調(diào)節(jié)劑添加到食品中。檸檬酸添加量結(jié)果如圖7所示。

圖7 檸檬酸的添加量對飲料感官評定的影響Fig.7 Effect of citric acid content on beverage sensory evaluation

由圖7可知，隨著檸檬酸添加量的增加，感官評價分數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，檸檬酸的添加量在0.15 g/L時為宜，檸檬酸用量會直接影響飲料的風味口感，若用量過少會使飲料失去酸的口感，甜味明顯；若用量過多則會導致飲料太酸，酸味突出，有澀口感，易失去復合飲料的特別風味。故選取檸檬酸添加量0.15 g/L為宜。

2.3 飲料配方的正交試驗優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取蛹蟲草浸提液和玫瑰花水的比例、玉米肽添加量、蜂蜜添加量、檸檬酸添加量為作為考察因素。蛹蟲草玉米肽復合飲料配方優(yōu)化的正交試驗結(jié)果與分析見表3。

由表3可知，影響飲料風味的因素主次順序為玉米肽添加量>蛹蟲草浸提液與玫瑰花水的比例>蜂蜜添加量>檸檬酸添加量，即影響最大的是玉米肽添加量，其次是蛹蟲草浸提液與玫瑰花水的比例和蜂蜜添加量，檸檬酸添加量對飲料品質(zhì)影響最小。由于玉米肽存在苦味，對飲料的影響較大，其他因素對飲料的口感影響較小。根據(jù)均值k確定最優(yōu)的組合為A2B1C2D3，即蛹蟲草浸提液：玫瑰花水=2∶1(mL∶mL)、10 g/L的玉米肽、80 g/L的蜂蜜、0.15 g/L的檸檬酸。按A2B1C2D3條件進行3次平行試驗，感官評價的平均值為94.31，高于表3中每一項試驗結(jié)果，故A2B1C2D3為最佳組合。

表3 蛹蟲草玉米肽復合飲料配方正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Orthogonal test results and analysis of Cordyceps militaris corn peptide compound beverage

2.4 產(chǎn)品質(zhì)量標準

2.4.1 感官評定

蛹蟲草玉米肽飲料呈淺黃色，無沉淀，溶液澄清透明，具有蛹蟲草獨特的風味(略帶苦味)，酸甜可口，無異味。

2.4.2 理化指標

纖溶酶活力為2.78 U/mL；蟲草素含量為12.43 μg/mL；多糖含量為199 mg/mL。

纖溶酶具有溶解纖維蛋白的能力，而纖維蛋白是血栓的主要成分。在生物化學中，纖維蛋白溶解簡稱為纖溶。血液中存在著凝血系統(tǒng)和纖維蛋白溶解系統(tǒng)，它們各受一系列酶促反應的調(diào)節(jié)，正常生理狀態(tài)下，這兩個系統(tǒng)保持動態(tài)平衡，既保證血液有潛在可凝固性，又保證血液的流體狀態(tài)。纖溶的生物學作用之一是去除血管、組織液中過剩的纖維蛋白沉積物，以保持血循環(huán)、組織液管道等的通暢。人體隨著年齡的增長，或長期飲食習慣不良或飲食結(jié)構(gòu)不當，可使體內(nèi)纖溶能力逐漸減弱，纖維蛋白就可能積累在血管內(nèi)，增加血栓傾向[20]。

含纖溶因子的功能性食物具有增加人體纖溶系統(tǒng)活性的功能[21-22]。有計劃地食用含纖溶因子的功能食品，可使體內(nèi)纖溶系統(tǒng)活性緩慢適量增強，逐漸恢復其正常生理狀態(tài)，降低血栓傾向[23-26]。以蛹蟲草子實體為原料研制的飲料具有較好的降低血栓傾向的功效。

蟲草素(cordycepin)是蛹蟲草的一種特殊的腺苷類似物活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)人體免疫、抑制腫瘤生長、抗菌抗病毒、治療白血病和消炎等多種功能[27-30]。

蟲草多糖是蛹蟲草中所含活性物質(zhì)中最豐富、最重要的物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價值和藥效功能，特別是其在抗氧化和提高機體免疫力的功能方面有明顯的效果，除此之外，蟲草多糖還具有降血壓、降血脂、抗腫瘤和保護肝臟等功能[31-34]。

2.5 抗氧化活性

2.5.1 蛹蟲草飲料DPPH·清除能力試驗

DPPH·是一種很穩(wěn)定的自由基，當樣品中存在清除劑時，其與DPPH中電子配對，使DPPH溶液被吸收而逐漸消失，DPPH溶液褪色程度與配對電子數(shù)成化學計量關(guān)系，因而可以通過分光光度法進行測定。由于飲料的顏色會對清除率的測定造成影響，故采用不同濃度的Vc溶液做對照。

蛹蟲草飲料與Vc抗氧化活性分析如表4所示，蛹蟲草飲料具有較強的清除DPPH自由基能力，在體積分數(shù)為10%時對DPPH·清除率就達到93.6%，與之相比Vc在20 μg/mL時清除率約為95.3%，因此對于DPPH·清除能力，每毫升蛹蟲草飲料中約相當于含有20 μg的Vc。

2.5.2 蛹蟲草飲料羥自由基(·OH)清除試驗

·OH清除是利用H2O2與Fe2+產(chǎn)生·OH，·OH與水楊酸反應生成2,3-二羥基苯甲酸，若在反應體系中加入具有清除·OH的物質(zhì)就會減少生成的·OH，通過測定吸光度計算可以得到·OH清除率。

隨著飲料濃度的增加，·OH清除能力逐漸增強，由于飲料濃度的增加，其與羥自由基作用的機會增大，使羥自由基與水楊酸作用的機會降低，從而使2,3-二羥基苯甲酸的生成量降低，清除率上升。蛹蟲草飲料在體積分數(shù)為10%時，·OH清除率為39.9%左右，同比Vc清除率在40 μg/mL時達到44.5% 左右。因此對于羥自由基清除能力，每毫升蛹蟲草飲料中約相當于含有40 μg的Vc。

2.5.3 蛹蟲草飲料還原力試驗

飲料中存在的抗氧化劑能使鐵氰化鉀的Fe3+還原成Fe2+，用三氯乙酸與反應后剩余的鐵氰化鉀反應生成沉淀通過離心除去，排除對吸光度數(shù)值的影響，F(xiàn)e2+進一步和FeCl3反應生成在700 nm處有最大吸光度的普魯士藍，因此測定700 nm處的吸光度的高低可以間接反映抗氧化劑的還原能力大小，吸光度越大還原能力越強。

隨著蛹蟲草飲料和Vc濃度的增加，吸光值逐漸升高，還原能力逐漸變強，即抗氧化能力越好。蛹蟲草飲料在蛹蟲草浸提液體積分數(shù)為10%，還原力為0.774左右，同比Vc清除率在20 μg/mL時達到0.782左右。因此對于還原力，每毫升蛹蟲草飲料中約相當于含有20 μg的Vc。

表4 飲料與Vc抗氧化活性分析Table 4 Analysis of antioxidant activities of beverages and Vc

注：Vc質(zhì)量濃度從左至右依次為20、40、20 μg/mL。

3 結(jié)論

本文以蛹蟲草子實體浸提液為原料，通過正交試驗確定蛹蟲草飲料的最佳配比為蛹蟲草浸提液：玫瑰花水(mL∶mL)=2∶1、10 g/L的玉米肽、80 g/L的蜂蜜、0.15 g/L的檸檬酸。此配方條件下，飲料的色澤、口感、氣味等為最佳，感官評價的平均值為94.31；纖溶酶活力為2.78 U/mL；蟲草素含量為12.43 μg/mL；多糖含量為199 mg/mL。對于DPPH·能力，每毫升蛹蟲草飲料中約相當于含有20 μg的Vc；對于OH·清除能力，每毫升蛹蟲草飲料中約相當于含有40 μg的Vc；在Fe3+還原力測定中，每毫升蛹蟲草飲料中約相當于含有20 μg的Vc，具有良好的抗氧化活性。