植物乳桿菌對辣白菜發(fā)酵過程中風味物質及菌群結構的影響

任大勇，高良鋒，楊柳，劉宏妍，于寒松，沈明浩

1(吉林農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，吉林 長春，130118) 2(吉林農(nóng)業(yè)大學 中藥材學院，吉林 長春，130118)

辣白菜是我國北方地區(qū)傳統(tǒng)泡菜的一種，屬于乳酸菌低溫發(fā)酵食品，與其他發(fā)酵蔬菜相似，微生物的代謝不僅賦予辣白菜豐富的營養(yǎng)物質[1-2]，同時還產(chǎn)生了獨特的風味[3-4]。這些風味主要包括滋味物質(有機酸，氨基酸，糖類等)和香氣物質(揮發(fā)性有機酸，醇類，酯類，芳香族化合物等)[5-6]。經(jīng)過臭氧滅菌處理的原料發(fā)酵得到的辣白菜在風味和安全性方面往往不被消費者所接受[7]，所以辣白菜的加工過程普遍采用原始生料，發(fā)酵過程利用白菜及配料自身攜帶的微生物來完成[8-9]，這樣豐富的代謝產(chǎn)物和復雜的微生物之間同樣也會相互影響，因此目前還沒能找到一種合理的方式來控制整個辣白菜的發(fā)酵過程中微生物和代謝產(chǎn)物的變化。

接種發(fā)酵通常采用單菌株或多菌株復合作為發(fā)酵劑，能達到縮短辣白菜發(fā)酵時間，延長保質期，改變風味等目的，是目前發(fā)酵蔬菜行業(yè)中公認的有效手段[10-11]。我國對辣白菜發(fā)酵劑的研究較少，韓國對于辣白菜發(fā)酵劑的研究較為成熟，已有Leuconostoc.citreumGJ7、Lactobacillus.plantarumPL62及Leuconostoc.mesenteroidesLK93等[12-14]發(fā)酵劑。研究表明辣白菜發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種主要包括明串珠菌、乳桿菌、以及魏斯氏菌[15-16]。關于發(fā)酵劑對風味的影響針對于明串珠菌的研究較多，但關于同樣在發(fā)酵過程中起到重要作用的乳桿菌對于風味的貢獻研究卻較少。

乳桿菌是辣白菜發(fā)酵中后期的優(yōu)勢菌屬之一，這些乳桿菌主要包括植物乳桿菌和沙克乳酸桿菌，但沙克乳酸桿菌很少能從辣白菜中分離出來，相比植物乳桿菌分離培養(yǎng)更加廣泛[17-18]。所以，本研究以前期篩選分離的耐鹽、耐低溫植物乳桿菌作為發(fā)酵劑；通過在辣白菜發(fā)酵前，投入該菌株，研究該菌株對于辣白菜發(fā)酵過程中微生物的變化，以及對可滴定酸、氨基酸、可溶性糖以及揮發(fā)性風味物質的影響，為辣白菜發(fā)酵劑的開發(fā)和辣白菜的品質控制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株:植物乳桿菌L12；大白菜(結球白菜)、辣椒粉、大蒜、姜、食鹽、白糖等;市售:NaOH、甲醛、HCl、CuSO4、酒石酸鉀鈉、乙酸鋅、冰醋酸、亞鐵氰化鉀(分析純)：北京化工廠；亞甲基藍(指示劑)：北京益利；MRS肉湯培養(yǎng)基：青島海博。

1.2 儀器與設備

PHS-3C pH計，上海佑科儀器儀表有限公司；5804R離心機，Eppendorf；BSA2245-CW電子天平，Sartorus；電加熱套、6890N—5975C氣相色譜—質譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 辣白菜樣品制備

去老葉→切分→稱重→腌制→清洗→抹料→發(fā)酵→保藏

將新鮮白菜去老葉，切分成4瓣，以質量為基重，用4% (質量分數(shù))食鹽腌制24 h，用清水清洗，瀝干，待用。用適量的熱水燙辣椒粉去苦，冷卻。將蘋果、梨、姜、蒜用搗碎機打碎成泥狀，按配料比例調(diào)制成辣白菜醬料，按每份占白菜總質量的百分數(shù)分配醬料，根據(jù)原料質量加入2%菌懸液(自然發(fā)酵組加入等量生理鹽水)，混勻。將醬料均勻涂抹在每一片菜葉，放在塑料保鮮盒中密封，于10 ℃發(fā)酵條件下發(fā)酵時間控制在11 d，每隔1 d取樣1次，將樣品打碎，檢測各項理化指標。

1.3.2 乳酸菌計數(shù)

依照國標GB/T 4789.35—2016[19]檢測乳酸菌數(shù)量。

1.3.3 可滴定酸檢測

依照國標GB/T 12456—2008[20]，樣品總酸含量≤4 g/kg，以乳酸作為換算系數(shù)，計算可滴定酸含量。

1.3.4 氨基酸態(tài)氮檢測

取5 g樣品用50 mL 80 ℃蒸餾水洗滌，冷卻后定容到100 mL，取20 mL濾液加入40 mL水，然后用NaOH溶液(c(NaOH)=0.1 mol/L)滴定至pH 8.2，再加入甲醛溶液10 mL充分混合后滴定至pH 9.2，通過NaOH溶液用量來計算氨基酸氮含量。

1.3.5 還原糖測定

依照國標GB 5009.7—2016[21]中第一法直接滴定法執(zhí)行操作。

1.3.6 風味物質分析(GC-MS)

GC條件：載氣為He；恒流；流速1 mL/min，初始溫度60 ℃，保留時間3 min，以5 ℃/min上升至100 ℃ 后，再以10 ℃/min上升至280 ℃，保留10 min。

MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃，掃描 20～800 u。

1.3.7 微生物多樣性檢測

將微生物DNA從樣品中抽提出來，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提出的DNA，采用通用引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，806R：5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′擴增DNA中V3、V4區(qū)域，然后，將所得擴增產(chǎn)物通過Miseq建庫并檢測，將所得結果采用OTU聚類整合分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

檢測結果利用GraphPad Prism 5進行統(tǒng)計分析；GC-MS得到離子色譜圖，通過計算機譜庫檢索，去除相似度低于80%組分，確定辣白菜風味化學成分。

2 結果與分析

2.1 接種發(fā)酵對乳酸菌數(shù)量的影響

發(fā)酵過程中除原料本身外，微生物的代謝對于辣白菜的風味有很大影響，而辣白菜發(fā)酵過程中的微生物以乳酸菌為主。從圖1中可以看出，接種發(fā)酵組在發(fā)酵第5天微生物數(shù)量達到最高7.34 lg CFU/g，而后基本保持不變，相比之下自然發(fā)酵組在第7天乳酸菌數(shù)量才達到最高值，且到達穩(wěn)定期后乳酸菌總數(shù)也略低于接種發(fā)酵組。

圖1 發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量的變化Fig.1 Viability of lactic bacteria during spicy cabbage fermentation

2.2 植物乳桿菌對pH和可滴定酸的影響

有機酸是辣白菜中重要風味物質之一，pH也是用來衡量產(chǎn)品是否發(fā)酵成熟的一個標志。一般認為pH值在4.2～5.0時為最適宜儲藏時期和最佳的食用時期。從圖2可知，自然發(fā)酵組pH值和可滴定酸含量變化較為平緩。

A-pH值變化；B-可滴定酸含量變化圖2 發(fā)酵過程中pH值和可滴定酸的變化Fig.2 Change in pH and titratable acidity during spicy cabbage fermentation

隨發(fā)酵時間的延長，總酸含量不斷增加，pH值不斷下降；而接種發(fā)酵在3～5 d，pH和可滴定酸含量出現(xiàn)較大變化，pH迅速降低，酸度迅速增加，其他時間變化趨勢平緩，這與乳酸菌總數(shù)變化的結果相一致，說明植物乳桿菌的加入能促進辣白菜總酸量的增加，并加快成熟速度，縮短發(fā)酵時間。

2.3 植物乳桿菌對發(fā)酵過程中還原糖的影響

還原糖是乳酸菌的主要碳源和能量源，糖代謝也是許多風味物質的形成途徑。由圖3可以看出，在發(fā)酵前3 d，還原糖含量升高，可能是由于這段時間內(nèi)能分解非還原糖的微生物作用，使樣品中蔗糖等多糖類化合物分解為還原糖，而隨著乳酸菌數(shù)量的增加，對于還原糖的利用也隨之增加，直至乳酸菌和其他微生物數(shù)量達到相對穩(wěn)定，還原糖含量也相對穩(wěn)定。相比于自然發(fā)酵，接種發(fā)酵樣品還原糖含量相對較高，可能是由于在植物乳桿菌的影響下促進了體系中非還原糖向還原糖的轉化。

圖3 發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.3 Change in reducing sugars during spicy cabbage fermentation

2.4 植物乳桿菌對氨基酸的影響

通過氨基酸態(tài)氮可以反映出產(chǎn)品中氨基酸的含量，氨基酸也是樣品中的代謝產(chǎn)物，由圖4可知，兩組樣品氨基酸含量都隨著發(fā)酵的進行而增加，這與JEONG等[22]對于辣白菜中的氨基酸研究結果相近。

圖4 發(fā)酵過程中氨基酸含量的變化Fig.4 Changes in amino acid content during spicy cabbage fermentation

王曉飛[23]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌能在泡菜發(fā)酵時通過分解蛋白質產(chǎn)生丙氨酸，精氨酸，異亮氨酸等促進氨基酸含量增加，而從圖4結果也可以看出，接種發(fā)酵組在發(fā)酵過程中氨基酸含量始終高于自然發(fā)酵組，最大氨基酸含量差異出現(xiàn)在第7天，接種發(fā)酵組氨基酸質量分數(shù)達到0.079 5%之后漲勢趨于平緩，而自然發(fā)酵組氨基酸質量分數(shù)在第9天達到0.078%，之后增長率降低。

2.5 植物乳桿菌對發(fā)酵過程中揮發(fā)性風味成分的影響

從上述結果中可見，在整個發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量和非揮發(fā)性風味物質在第1～7天變化較為明顯，所以選取這段時間內(nèi)的第1天，第4天和第7天3個時間節(jié)點檢測辣白菜的揮發(fā)性風味成分。從表1結果可以看出，兩組辣白菜樣品中共檢測出揮發(fā)性風味成分84種，其中包括硫化物4種、烯烴16種、醇類9種、醛類18種、酮類2種、酸類7種、酯類25種、芳香族化合物3種。其中硫化物在發(fā)酵的前期基本相似，發(fā)酵過程中，接種發(fā)酵樣品中二甲基二硫化物和二甲基三硫化物含量都有所增加，而自然發(fā)酵組中，只有二甲基二硫化物化物在發(fā)酵到第4天時含量增加，其他各硫化物含量都與發(fā)酵第1天相近；烯烴是2組樣品中含量較高也較豐富的一類成分，2組樣品共有的成分有12種，在不同發(fā)酵時間含量相近，剩余的4種差異性成分含量均相對較低；除十二烯醇在發(fā)酵第1天短暫出現(xiàn)外，其他幾種醇類成分幾乎在2組樣品中均有出現(xiàn)，在發(fā)酵的第4天，2組樣品醇類成分種類完全一致，但發(fā)酵到第7天，自然發(fā)酵組中1-己醇和4-萜烯醇兩種物質未能測出；醛類成分也是2組樣品中種類較豐富的物質之一，2組中共有的醛類物質有11種，但從含量上來看，接種發(fā)酵第1天醛類總質量分數(shù)在7.9%，第4天和第7天時質量分數(shù)分別只有3.62%和4.29%，明顯降低，而自然發(fā)酵組中，1～4 d同樣表現(xiàn)出降低的趨勢，但第7天檢查出的含2-壬烯醛(黃瓜味、清香味)質量分數(shù)高達到12.54%；酮類成分種類相似，自然發(fā)酵組含量略高于接種發(fā)酵組；相比之下，酸類揮發(fā)性成分含量并不高，2組中共有的酸類成分有4種，其余2種均出自于接種發(fā)酵中，說明植物乳桿菌的接種對揮發(fā)性酸類物質的豐富有明顯作用；酯類是揮發(fā)性成分中種類最豐富、含量最高的成分，也是2組間種類差異最大的風味物質，其中異硫氰酸苯乙酯和3-丁烯基異硫氰酸酯含量是樣品中含量較高的兩種成分，其中差異成分有8種，接種發(fā)酵樣品中有部分酯類成分僅在第1天或第4天測出，導致第7天時酯類物質種類下降；對于芳香族化合物兩組間差異不大，只有2,4-二叔丁基酚化合物僅在自然發(fā)酵的第1天和第4天存在。結合上述結果，說明植物乳桿菌的接種造成發(fā)酵過程中的風味物質成分明顯變化，通過感官評價對比，發(fā)現(xiàn)兩組樣品最高感官得分相近，說明變化后的風味成分并未對感官造成負面影響。

表1 辣白菜發(fā)酵過程中主要揮發(fā)性風味成分及相對含量變化Table 1 Changes of main volatile flavor components and relative contents during spicy cabbage fermentation

續(xù)表1

類別物質名稱氣味描述相對含量/%J-1J-4J-7Z-1Z-4Z-7酸類辛酸汗水,奶酪0.21十二烷酸金屬0.13十四烷酸0.120.130.130.110.150.16正十六烷酸0.851.281.330.831.822.03(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸0.110.330.090.2油酸脂肪0.160.15酯類辛酸乙酯水果,脂肪0.130.170.110.21水楊酸甲酯薄荷味0.06異丙酸三異丙酯0.17癸基-3-甲基丁-3-烯基富馬酸酯0.490.653-丁烯基異硫氰酸酯10.559.5211.058.348.728.99二氫獼猴桃內(nèi)脂0.210.180.160.250.240.2212-甲基三癸酸甲酯0.26十四烷酸甲酯鳶尾草味0.34十四烷酸乙酯醚味0.180.120.170.220.220.261,4-甲基-十五烷酸甲酯0.470.350.55十六烷酸甲酯蠟味0.380.470.46(Z)-9-十六碳烯酸甲酯0.05十六碳-9-烯酸酯甲基0.069-十六烯酸乙酯0.230.289,12-十八碳二烯酸甲酯0.088-十八碳烯酸甲酯0.120.18,11-十八碳二烯酸甲酯0.470.380.579-十八碳烯酸甲酯0.10.120.120.159-十八碳烯酸乙酯0.079,12-十八碳二烯酸甲酯0.330.450.450.099,12,15-十八碳三烯酸乙酯0.080.070.140.10.130.12油酸乙酯0.140.060.220.180.26亞油酸乙酯0.650.260.560.810.771.04芐基異硫氰酸酯辛辣0.40.560.350.48異硫氰酸苯乙酯7.714.54.527.915.467.76其他2-甲氧基-4-乙烯基苯酚杏仁0.240.120.152,4-二叔丁基酚0.180.1苯代丙腈0.770.570.670.730.630.67

注： J代表接種發(fā)酵，Z代表自然發(fā)酵。下同。

通過比較各成分相對含量，2種辣白菜的主要揮發(fā)性成分相似，主要包括二甲基二硫化物(洋蔥味，白菜味)、二甲基三硫化物(白菜味，魚味)、茴香烯、黃姜烯(青草味)、姜烯(香料味，清新味)、紅沒藥烯(香油味)、芳樟醇(花香，薰衣草味)、2-甲基-3-苯基-丙醛、(E，E)-2,4-癸二烯醛(海草味)、3-丁烯基異硫氰酸酯和異硫氰酸苯乙酯。由于發(fā)酵的原料和發(fā)酵工藝的差異，發(fā)酵泡菜的揮發(fā)性風味成分也各有不同，主要成分也有差異，但其中二甲基二硫化物、二甲基三硫化物以及異硫氰酸苯乙酯廣泛存在于各種辣白菜中[23-27]，這與本研究的結果相近。二甲基二硫化物和二甲基三硫化物閾值較低，是辣白菜中重要的風味物質[23-25]，通過對比接種發(fā)酵和自然發(fā)酵樣品，二甲基二硫化物和二甲基三硫化物的含量明顯增加，說明該植物乳桿菌對辣白菜的揮發(fā)性成分有明顯的改善作用。

2.6 植物乳桿菌對菌群結構的影響

如圖5所示，當發(fā)酵到第7天接種發(fā)酵樣品中乳桿菌占相對含量的98.16%，明串珠菌占1.08%，魏斯氏菌占0.03%，自然發(fā)酵組中乳桿菌占相對含量的21.98%，明串珠菌占65.02%。魏斯氏菌占1.1%，從這個結果上可以看出，接種發(fā)酵后乳桿菌屬在樣品中占領絕對優(yōu)勢，也導致其他細菌的含量降低，相比于自然發(fā)酵微生物豐富度較低。

圖5 發(fā)酵第7天辣白菜中細菌物種分布Fig.5 Genus-level distribution of bacterial from spicy cabbage samples at the 7th day of fermentation

3 結論

本研究通過對比自然發(fā)酵和以植物桿菌作為發(fā)酵劑的接種發(fā)酵辣白菜發(fā)酵過程中非揮發(fā)性風味物質和揮發(fā)性風味物質發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌接種能使辣白菜發(fā)酵過程中乳酸菌總數(shù)增加，從而促進非揮發(fā)性酸類物質的產(chǎn)生，加快辣白菜的成熟，縮短發(fā)酵周期，酸類物質主要由乳酸菌的糖代謝產(chǎn)生，但接種后發(fā)酵的辣白菜樣品中還原糖含量卻高于自然發(fā)酵組，這可能是由于植物乳桿菌在增加還原糖代謝的同時也促進了其他非還原糖向還原糖的轉化，同時，接種發(fā)酵也可以促進氨基酸的產(chǎn)生，提高氨基酸總量；從揮發(fā)性風味物質的檢測結果表明，無論自然發(fā)酵還是接種發(fā)酵的過程中揮發(fā)性成分都是不斷變化的，植物乳桿菌的接種也造成了揮發(fā)性風味成分的變化，最突出的變化表現(xiàn)在醇類和酸類成分種類的增加以及其中酯類化合物種類的變化。微生物結果表明，植物乳桿菌接種會增加發(fā)酵體系中乳桿菌屬的含量，乳桿菌屬大多屬于同型發(fā)酵乳酸菌，產(chǎn)酸量較高，這與非揮發(fā)性風味物質中酸量增加結果一致，從風味上看也造成部分香氣成分的損失，但二甲基二硫化物和二甲基三硫化物含量明顯增加。

綜上所述，植物乳桿菌的加入，能加快辣白菜的發(fā)酵，縮短發(fā)酵時間，增加非揮發(fā)性酸的含量和揮發(fā)性酸的種類。雖然其他微生物在發(fā)酵結束時含量較低，但它們對辣白菜風味產(chǎn)生的影響同樣不容忽視，在復雜的發(fā)酵體系中，植物乳桿菌與這些微生物之間的相互作用仍有待于進一步研究。