重組禽流感病毒二價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-8 株和H7N9 H7-Re1 株）對(duì)雉免疫效果的研究

顏克旭，楊 輝，奉 佳，寧華杰，劉增再，譚 丹，薛 爽，王洪亮，朱紅剛，王昌建

（1. 長(zhǎng)沙市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長(zhǎng)沙 410013；2. 湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長(zhǎng)沙 410019）

高致病性禽流感（HPAI）是養(yǎng)禽業(yè)的頭號(hào)殺手，是具有極大公共衛(wèi)生意義的人獸共患病。目前，在我國(guó)引起HPAI的病原包括H5和H7亞型流感病毒。我國(guó)對(duì)HPAI 防控采取免疫與撲殺相結(jié)合的綜合措施[1]。但高免疫壓力可使HPAI 流行毒株基因變異速度加快[2]，并導(dǎo)致免疫失敗。2017 年暴發(fā)的家禽高致病性H7N9 疫情，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，也帶來(lái)了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生威脅。為有效控制禽間疫情，我國(guó)緊急啟用了包含（H5N1 Re-8株和H7N9 H7-Re1 株）兩個(gè)疫苗株的重組禽流感病毒（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗[3]，以控制HPAI 的蔓延和擴(kuò)散，并取得了顯著的防控成效。

近年來(lái)，禽流感在野生鳥(niǎo)類、動(dòng)物園珍禽中也有暴發(fā)[4]，不僅對(duì)珍稀家禽的繁育保護(hù)帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)，還對(duì)人類健康造成很大威脅[5]。2015 年美國(guó)華盛頓地區(qū)發(fā)生雉雞H5N2 疫情，死亡率達(dá)10%，患病雉雞精神沉郁，全身多處發(fā)生炎癥并表現(xiàn)出血癥狀[6]。因此，采取有效的預(yù)防措施，加強(qiáng)對(duì)野生禽類的保護(hù)，不僅可防止疫情的暴發(fā)，還可保護(hù)公共安全。雉屬珍禽，俗稱“野雞”，部分品種已開(kāi)始人工飼養(yǎng)，飼養(yǎng)價(jià)值較高。為掌握重組禽流感病毒二價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-8 株和H7N9 H7-Re1 株）對(duì)雉的臨床免疫效果，本試驗(yàn)選擇政府采購(gòu)重組禽流感病毒（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗，對(duì)農(nóng)戶飼養(yǎng)的雉進(jìn)行注射免疫，跟蹤觀察免疫后的臨床變化，并進(jìn)行抗體水平檢測(cè)，以期了解H5 和H7 亞型HI 抗體效價(jià)在雉體內(nèi)的消長(zhǎng)規(guī)律，為科學(xué)推薦雉等珍稀禽的免疫疫苗種類和免疫程序提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 重組禽流感病毒二價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-8 株和H7N9 H7-Re1 株）：生產(chǎn)批號(hào)01721177，肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 主要試劑 禽流感病毒H5、H7 亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原與陽(yáng)性血清：購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；禽流感病毒H5、H7 亞型熒光RTPCR 檢測(cè)試劑盒：購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1.1.3 主要儀器和耗材 一次性96 孔血凝板（V 型底）、移液器、微量振蕩器、低速離心機(jī)、ABI7500-FSAT 熒光PCR 儀等。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組與接種 試驗(yàn)于2018 年5 12 月在長(zhǎng)沙市瀏陽(yáng)市淳口鎮(zhèn)某生態(tài)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。選取未免疫禽流感疫苗的30 日齡雉35 羽，設(shè)免疫組和對(duì)照組（免疫組25 羽、對(duì)照組10 羽），用腳環(huán)進(jìn)行區(qū)分。30 日齡首免，51 日齡二免，免疫劑量為0.3 mL/羽，采用胸部肌內(nèi)注射。對(duì)試驗(yàn)組、對(duì)照組在飼料、飼養(yǎng)環(huán)境等方面提供相同的條件。

1.2.2 免疫副反應(yīng)觀察 分別于免疫后 0、4、8、12、24、36、48、60 和72 h，觀察群體臨床變化并記錄。

1.2.3 樣品采集 分別在免疫前及免疫后14、21、28、35、49、77、105、133、161、189 d，采集試驗(yàn)動(dòng)物血液樣品，分離血清，-20 ℃保存待檢。

1.2.4 檢測(cè) 應(yīng)用HA-HI 試驗(yàn)[7]檢測(cè)血清中的H5（Re-8）、H7（Re-1）抗體，依據(jù)《2018 年國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》（農(nóng)醫(yī)發(fā)﹝2018﹞17 號(hào)）進(jìn)行判定，即抗體效價(jià)≥4log2判定為抗體合格，合格率（抗體合格的樣品數(shù)占同組樣品總數(shù)的比率）≥70%為群體免疫合格。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

試驗(yàn)雉免疫（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗后無(wú)不良組織反應(yīng)產(chǎn)生，精神狀況良好，食欲及生長(zhǎng)發(fā)育正常。

2.2 H5、H7 亞型抗體

免疫前后的H5、H7 亞型HI 抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1 和圖1，合格率結(jié)果見(jiàn)表2 和圖2，變異系數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。雉疫苗免疫后14 d，H5、H7 亞型平均抗體效價(jià)均上升至合格效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（4log2）以上，并獲得70%以上的群體合格率。H5 亞型抗體有效持續(xù)期（平均抗體效價(jià)≥4log2、群體合格率≥70%）在105 d 以上，免疫組各時(shí)間點(diǎn)抗體效價(jià)整齊度高，變異系數(shù)在0.14~0.41 之間，平均變異系數(shù)為0.26；H7 亞型抗體有效持續(xù)期（平均抗體效價(jià)≥4log2、群體合格率≥70%）在189 d以上，免疫組各時(shí)間點(diǎn)抗體效價(jià)變異系數(shù)整齊度高，在0.12~0.32 之間，平均變異系數(shù)為0.23。

表1 免疫后不同時(shí)期的H5 與H7 亞型抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果 單位：log2

表2 免疫后不同時(shí)期的H5 與H7 亞型抗體合格率 單位：%

圖1 免疫后各時(shí)期抗體滴度

圖2 免疫后各時(shí)期抗體合格率變化

表3 免疫后不同時(shí)期的H5 與H7 亞型抗體效價(jià)變異系數(shù)

3 分析與討論

從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，免疫后0、14、21、28、35 和49 d，H5（Re-8 株）、H7（Re-1 株）抗 體合格率、平均抗體效價(jià)呈上升趨勢(shì)，最高峰分別為（8.04 1.5）log2 和（8.04 1.5）log2。免疫49 d 后，H5 和H7 亞型平均抗體效價(jià)逐漸下降。由此可見(jiàn)，兩種亞型的抗體消長(zhǎng)規(guī)律基本一致，但是H7 亞型抗體滴度和維持免疫合格的時(shí)間要比H5 亞型高和長(zhǎng)，差異極顯著（P ＜0.01），說(shuō)明（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗中的H7 亞型毒株更能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但也有可能是疫苗生產(chǎn)中的配比不同導(dǎo)致的。

本次試驗(yàn)表明，（H5+H7）重組二價(jià)滅活疫苗能給雉提供有效保護(hù)。徐娟等[8]利用重組禽流感病毒（H5 ＋H7）二價(jià)滅活疫苗，對(duì)9 家養(yǎng)禽場(chǎng)8 萬(wàn)多羽家禽進(jìn)行了免疫效果評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)政府統(tǒng)一供應(yīng)的重組禽流感病毒（H5 ＋H7）二價(jià)滅活疫苗免疫副反應(yīng)小，可放心使用，但需免疫2 次才能產(chǎn)生良好的免疫效果，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明重組禽流感病毒（H5 ＋H7）二價(jià)滅活疫苗不僅適用于家禽，同樣適用于野禽。

重組禽流感病毒二價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-8 株和H7N9 H7-Re1 株）對(duì)雉具有良好的臨床安全性，可產(chǎn)生明顯的免疫保護(hù)。變異系數(shù)反映了試驗(yàn)數(shù)據(jù)的離散程度。本次試驗(yàn)疫苗的抗體效價(jià)平均變異系數(shù)均在0.5 以下，最低的僅為0.07，表明試驗(yàn)疫苗的免疫效果受個(gè)體差異影響很小，群體免疫的均一性良好。

目前農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已經(jīng)調(diào)整高致病性禽流感疫苗生產(chǎn)種毒，要求2019 年1 月1 日起停止生產(chǎn)重組禽流感病毒二價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-8 株和H7N9 H7-Re1 株），使用新的重組禽流感病毒三價(jià) 滅 活 疫 苗（H5N1 Re-11 株+Re-12 株，H7N9 H7-Re2 株）代替。本次試驗(yàn)的方法、過(guò)程和推薦免疫程序可以為后續(xù)的研究和生產(chǎn)提供一定參考，但新的重組禽流感病毒三價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-11 株+Re-12 株，H7N9 H7-Re2 株）對(duì)野禽的免疫效果有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究表明，（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗對(duì)雉能產(chǎn)生良好的抗體反應(yīng)，具有較好的免疫保護(hù)效果，抗體效價(jià)整齊度高，同時(shí)無(wú)免疫不良反應(yīng)，疫苗安全有效。研究顯示，該疫苗免疫49 d 后，抗體水平逐漸下降，133 d 后明顯下降，群體免疫合格率低于70%，因此生產(chǎn)中推薦，30 日齡首免，51 日齡和5 月齡各加強(qiáng)免疫1 次。