茶皂素對(duì)甘薯小象甲的行為及生長發(fā)育的影響

潘如軍，唐秀樺，何龍飛，任立云*

(1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，廣西 南寧 530004；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】甘薯小象甲(Cylasformicarius)，又名甘薯蟻象，在全球熱帶及亞熱帶甘薯種植區(qū)普遍發(fā)生，在我國廣泛分布于南方產(chǎn)區(qū)，是國內(nèi)外進(jìn)出口檢疫的重要害蟲[1]。甘薯小象甲除成蟲咬食薯藤、葉、幼芽及薯塊外，其幼蟲還蛀食粗蔓和薯塊，在薯塊內(nèi)部形成隧道，受蛀食部位被誘導(dǎo)產(chǎn)生萜類和酚類等物質(zhì)[2-3]，使味道苦澀，品質(zhì)下降，以至于不能食用或飼用。該蟲每年發(fā)生6～8代，存在世代重疊現(xiàn)象[4]。發(fā)生該蟲的大多數(shù)疫區(qū)薯塊為害率高達(dá)60 %～100 %[5]，而因此造成的甘薯產(chǎn)量損失達(dá)5 %～20 %，嚴(yán)重地區(qū)達(dá)30 %以上[6]。茶皂素(Tea saponin)是一種五環(huán)三萜類皂苷物質(zhì)[7]，又稱作茶皂甙、皂甙、皂角甙，是性能優(yōu)良的新型天然非離子表面活性劑[8]，在山茶科(Theacease)山茶屬(Camellia)植物中含量非常豐富[9]。因具有高效的發(fā)泡、乳化、分散、潤濕等作用[10]，同時(shí)還具有直接的殺蟲活性，茶皂素的應(yīng)用領(lǐng)域拓展到了農(nóng)藥行業(yè)。研究茶皂素對(duì)甘薯小象甲的防治作用，對(duì)甘薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前已登記的30 %茶皂素水劑實(shí)際防治效果良好，對(duì)茶小綠葉蟬(EmpoascapirisugaMatumura)的防治在噴藥后7d的平均防效高達(dá)90.05 %[11]；陳充等[12]在對(duì)甘藍(lán)菜青蟲(Plutellaxylostella)的田間防治中，每0.067 hm2施用233 mL的30 %茶皂素水劑的總體防效達(dá)89.86 %，并且對(duì)比每0.067 hm2施用80 mL的48 %毒死蜱乳油無顯著差異；此外，30 %茶皂素水劑對(duì)尺蛾卵還有極強(qiáng)的毒殺作用，對(duì)其幼蟲有較強(qiáng)的忌避和拒食作用[13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然已有多項(xiàng)試驗(yàn)證實(shí)茶皂素具有殺蟲活性，但尚未明確其對(duì)甘薯小象甲是否具有抑制作用。【擬解決的關(guān)鍵問題】對(duì)甘薯小象甲在茶皂素作用下的嗅覺趨向及取食行為進(jìn)行生物學(xué)測(cè)定，并采用人工飼料法測(cè)定茶皂素對(duì)該蟲發(fā)育歷期以及生存情況的影響，挖掘茶皂素的應(yīng)用潛力，為甘薯小象甲茶皂素類殺蟲劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

茶皂素粉劑(純度≥98 %)，用電子天平(SartoriusBSA224S-CW，德國賽多利斯集團(tuán))稱取20.0 g茶皂素粉劑，加入100.0 mL蒸餾水配置成20.0 %(g/v)的茶皂素水溶液，再依次稀釋為10.0 %、5.0 %、1.0 %、0.5 %(g/v)的茶皂素水溶液，備用。

甘薯品種為海南雞蛋黃，購自廣西南寧市大康惠超市，帶回實(shí)驗(yàn)室用清水沖洗干凈后晾干備用。

甘薯小象甲采自廣西大學(xué)農(nóng)場(chǎng)甘薯田，置于人工氣候箱(RPX-250C，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)中，在(28±1)℃、65 %±3 %RH條件下用甘薯繁殖2～3代，取羽化5～8 d的甘薯小象甲成蟲用于試驗(yàn)。

人工飼料配方[14]：抗壞血酸(1.8 g)、豆甾醇(720.0 mg)、對(duì)羥基苯甲酸甲酯(675.0 mg)、山梨酸鉀(675.0 mg)、酵母膏(9.0 g)、氯化膽堿(450.0 mg)、瓊脂粉(40.0 g)、混合維生素B(45.0 mg)、纖維素(14.4 g)、肌醇(360.0 mg)、混合鹽(2.7 g)、葡萄糖(40.0 g)、干酪素(21.6 g)、無水乙醇(20.0 mL)、鹽酸四環(huán)素(200.0 mg)、蒸餾水(900.0 mL)、甘薯粉(80.0 g)，其中甘薯粉為新鮮甘薯切片烘干(60 ℃，4 h)后打成粉末制成。

人工飼料配制方法：在蒸餾水加入瓊脂粉并煮沸，再冷卻至55 ℃；加入甘薯粉、葡萄糖、干酪素、纖維素、混合鹽、酵母膏和抗壞血酸，充分?jǐn)嚢? min以上。將混合維生素B、氯化膽堿、肌醇、豆甾醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀及鹽酸四環(huán)素(含0.5 %和1.0 %茶皂素的處理組中還需分別加入4.6 g和9.2 g的茶皂素粉末)加入無水乙醇中攪拌至溶解，再加入瓊脂混合物混合攪拌2 min以上，最后把配制好的人工飼料裝入培養(yǎng)管(有透氣孔的0.5 mL離心管)中，冷卻待用。

1.2 甘薯小象甲對(duì)茶皂素嗅覺趨向的測(cè)定

Y型嗅覺儀的連接順序：將干燥塔(高32.0 cm，直徑4.0 cm)依次連接玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)(LZB-3，常州鑫旺儀表有限公司；空氣 20 ℃ 101.3 kPa l/min)、樣品瓶(高10.0 cm，直徑6.5 cm)、Y型管(叉管長15.0 cm，底管長13.0 cm，管徑3.0 cm)、抽氣泵(真空泵VLC6503-24V、調(diào)速器TAA02-24V，成都?xì)夂C(jī)電制造有限公司)。打開抽氣泵電源，將流量計(jì)流量調(diào)至0.8L/min，嗅覺儀系統(tǒng)連續(xù)抽氣10 min，使系統(tǒng)內(nèi)流量穩(wěn)定至規(guī)定值。

分別量取3.0 mL系列濃度為0.5 %、1.0 %、5.0 %、10.0 %和20.0 %的茶皂素水溶液，按濃度由低到高的順序依次放入樣品瓶，每個(gè)濃度作為1個(gè)處理，在對(duì)照瓶中放入同樣體積的清水作為對(duì)照。試驗(yàn)在室內(nèi)遮光環(huán)境[T：(27±2)℃，RH：65 %±5 %]下進(jìn)行，選取10頭健康的甘薯小象甲成蟲從Y型管的直臂端引入，打開抽氣泵電源等待氣流穩(wěn)定后開始試驗(yàn)，10 min后分別觀察和記錄處理臂與對(duì)照臂甘薯小象甲的數(shù)量，重復(fù)6次。

1.3 甘薯小象甲對(duì)茶皂素取食選擇的測(cè)定

采用選擇性測(cè)定法。用打孔器得到圓柱形(長3.0 cm，直徑1.5 cm)薯塊分別浸于系列濃度為0.5 %、1.0 %、5.0 %、10.0 %和20.0 %的茶皂素水溶液中，20 s后取出晾干，放入培養(yǎng)皿(直徑7.5 cm)的一側(cè)，以同樣大小的薯塊浸漬清水后取出晾干放入同一培養(yǎng)皿的另一側(cè)作為對(duì)照，然后分別接入已饑餓4 h的甘薯小象甲成蟲10頭，置于培養(yǎng)箱[T：(28±1)℃，RH：65 %±3 %]中，分別于1和6 h后記錄處理薯塊和對(duì)照薯塊上的甘薯小象甲數(shù)量，重復(fù)6次。

1.4 茶皂素對(duì)甘薯小象甲茶的拒食作用測(cè)定

采用非選擇性測(cè)定法。用打孔器得到圓柱形(長3.0 cm，直徑1.5 cm)薯塊分別浸于系列濃度為0.5 %、1.0 %、5.0 %、10.0 %和20.0 %的茶皂素水溶液中，20 s后取出晾干，放入培養(yǎng)皿(直徑7.5 cm)中，每皿放薯塊1塊，然后分別接入已饑餓4 h的甘薯小象甲成蟲10頭，置于培養(yǎng)箱[T：(28±1)℃，RH：65 %±3 %]中飼養(yǎng)；將同樣大小的薯塊浸入清水中，20s后取出晾干，放入同樣規(guī)格的培養(yǎng)皿中作為對(duì)照。12、24、48及72 h后分別記錄處理薯塊和對(duì)照薯塊上的取食孔數(shù)量，重復(fù)6次。

1.5 茶皂素對(duì)甘薯小象甲幼蟲發(fā)育歷期和死亡率的影響

將40頭雌蟲和10頭雄蟲放入含有未被甘薯小象甲侵染的甘薯塊的培養(yǎng)瓶(高9.0 cm，直徑9.0 cm)中，任其交配與產(chǎn)卵；2 d后取出甘薯及其表皮下的蟲卵，分別轉(zhuǎn)移至裝含0.5 %、1.0 %茶皂素和不含茶皂素的人工飼料的培養(yǎng)管(0.5 mL離心管)中，每管接入1粒卵(用針頭在飼料基質(zhì)表面戳出小孔，將卵嵌入其中)，逐一對(duì)培養(yǎng)管編號(hào)，置于培養(yǎng)箱[T：(28±1)℃，RH：65 %±3 %]中培養(yǎng)，接卵后每天逐一觀察培養(yǎng)管中甘薯小象甲各蟲期的發(fā)育情況，記錄卵、幼蟲和蛹的發(fā)育歷期及死亡數(shù)量。每個(gè)處理20管(1頭蟲/管)，重復(fù)3次，共180管。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)”表示，采用SPSS20.0軟件分析。采用單因素方差分析和Duncan多重比較法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)顯著性。采用生存函數(shù)壽命表對(duì)試蟲幼體生存情況進(jìn)行分析。

拒食率(%)=

校正死亡率(%)=

2 結(jié)果與分析

2.1 茶皂素對(duì)甘薯小象甲嗅覺趨向的影響

由表1可知，0.5 %茶皂素的嗅覺忌避率為0.00 %，處理臂蟲數(shù)與對(duì)照臂蟲數(shù)之間差異不顯著(P>0.05，下同)，表明該濃度茶皂素對(duì)甘薯小象甲未產(chǎn)生顯著影響；1.0 %、5.0 %和10.0 %茶皂素的嗅覺忌避率都為負(fù)值，表明以上濃度的茶皂素對(duì)甘薯小象甲具有引誘作用，但處理臂蟲數(shù)與對(duì)照臂蟲數(shù)之間差異不顯著；20.0 %茶皂素的嗅覺忌避率為9.14 %，但處理臂蟲數(shù)也與對(duì)照臂蟲數(shù)之間差異不顯著，表明該濃度茶皂素對(duì)甘薯小象甲具有嗅覺忌避作用，但十分有限。由此可見，茶皂素對(duì)甘薯小象甲不具有明顯嗅覺忌避作用和引誘作用。

2.2 茶皂素對(duì)甘薯小象甲取食的忌避作用

由表2可知，茶皂素對(duì)甘薯小象甲具有取食忌避作用，且隨著茶皂素濃度增大作用增強(qiáng)；1 h時(shí)，0.5 %和1 %茶皂素的取食忌避作用較低，5.0 %、10.0 %和20.0 %茶皂素的取食忌避率較高，分別為59.88 %、80.00 %和86.67 %，3個(gè)處理組蟲數(shù)與對(duì)照組蟲數(shù)之間差異顯著(P<0.05，下同)；6 h時(shí)各濃度茶皂素對(duì)甘薯小象甲的取食忌避作用相對(duì)于1h都更明顯，并隨著茶皂素濃度增大而增強(qiáng)，0.5 %、1.0 %、5.0 %、10.0 %和20.0 %茶皂素的取食忌避作用都較強(qiáng)，取食忌避率分別為58.14 %、77.77 %、88.23 %、95.00 %和97.65 %，且各處理組蟲數(shù)與對(duì)照組蟲數(shù)之間均存在顯著差異。

表1 甘薯小象甲對(duì)茶皂素產(chǎn)生的嗅覺忌避率

注：表中數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

Note: Data in the table is mean values ±SE.

表2 茶皂素對(duì)甘薯小象甲的取食忌避率

注：表中數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，*表示處理組與對(duì)照組之間存在顯著差異(P<0.05)。

Note：Data in the table is mean values ±SE. *indicates significant differences between treatment groups and control groups atP<0.05.

2.3 茶皂素對(duì)甘薯小象甲的拒食作用

各濃度茶皂素對(duì)甘薯小象甲都具有拒食作用，但未發(fā)現(xiàn)具有急性毒性。由表3可知，12h時(shí)0.5 %和1.0 %茶皂素的拒食率為36.26 %和37.50 %，其取食孔數(shù)與對(duì)照組之間差異顯著；5.0 %、10.0 %和20.0 %茶皂素的拒食率為85.00 %、81.25 %和92.50 %，其取食孔數(shù)與對(duì)照組之間差異顯著。24 h時(shí)甘薯小象甲對(duì)0.5 %和1.0 %茶皂素的拒食率為56.55 %和62.50 %，其取食孔數(shù)與對(duì)照組之間差異顯著；對(duì)5.0 %、10.0 %和20.0 %茶皂素的拒食率為85.00 %、81.25 %和92.50 %，其取食孔數(shù)與對(duì)照組之間差異顯著。48 h時(shí)甘薯小象甲對(duì)0.5 %和1.0 %茶皂素的拒食率為66.95 %和66.27 %，其取食孔數(shù)與對(duì)照組之間差異顯著；對(duì)5.0 %、10.0 %和20.0 %茶皂素的拒食率為96.39 %、95.48 %和98.19 %，其取食孔數(shù)與對(duì)照組之間差異顯著。72 h時(shí)甘薯小象甲對(duì)0.5 %和1.0 %茶皂素的拒食率為63.01 %和67.54 %，其取食孔數(shù)與對(duì)照組之間差異顯著；對(duì)5.0 %、10.0 %和20.0 %茶皂素的拒食率為97.14 %、96.42 %和98.57 %，其取食孔數(shù)與對(duì)照組之間差異顯著。

由圖1可見，甘薯小象甲對(duì)各濃度茶皂素拒食率隨時(shí)間推移都呈逐漸增長趨勢(shì)，其中，對(duì)0.5 %和1.0 %茶皂素的拒食率在24～72 h內(nèi)趨于平穩(wěn)，拒食率為56.55 %～67.54 %，與其他3個(gè)濃度相比，拒食率數(shù)值保持在居中水平，這意味著甘薯小象甲對(duì)0.5 %和1.0 %茶皂素的進(jìn)食與拒食相對(duì)平衡，此時(shí)可以保證甘薯小象甲可以最大程度地將茶皂素?cái)z入體內(nèi)，這有助于開展關(guān)于茶皂素對(duì)甘薯小象甲長期影響的研究。

表3 茶皂素對(duì)甘薯小象甲的拒食率

注：表中數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，同列中數(shù)字后不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Data in the table is mean values ±SE，mean values within a column with different letters are significantly different atP<0.05.

表4 茶皂素影響下甘薯小象甲的幼體歷期及死亡率

注：表中數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，*表示處理組與對(duì)照組之間經(jīng)t-檢驗(yàn)存在顯著差異(P<0.05)。

Note：Data in the table is mean values±SE. *indicate significant differences between treatment group and control group atP<0.05.

2.4 茶皂素對(duì)甘薯小象甲卵、幼蟲及蛹階段歷期及生存的影響

由表4可知，甘薯小象甲的卵、幼蟲和蛹?xì)v期隨茶皂素濃度的升高而不斷縮短，且幼體發(fā)生死亡，幼蟲期死亡率最高。0.5 %茶皂素影響下的卵歷期為7.29 d，較對(duì)照組縮短了1.44 d，差異顯著；1.0 %茶皂素影響下的卵歷期為6.90 d，較對(duì)照組縮短了1.83 d，差異顯著。0.5 %茶皂素影響下的幼蟲歷期為22.88 d，較對(duì)照組縮短了0.62d，差異顯著，校正死亡率為13.30 %；1.0 %茶皂素影響下的幼蟲歷期為22.07 d，較對(duì)照組縮短了1.43 d，差異顯著，其死亡蟲數(shù)與對(duì)照組和0.5 %茶皂素組的差異顯著，校正死亡率為53.33 %。0.5 %茶皂素影響下的蛹?xì)v期為6.44 d，較對(duì)照組縮短了0.68 d，差異顯著，其死亡蟲數(shù)與對(duì)照組和0.5 %茶皂素組的差異顯著；1.0 %茶皂素影響下的幼蟲歷期為5.69 d，較對(duì)照組縮短了0.75 d，差異顯著，較0.5 %茶皂素組縮短了0.07 d，其死亡蟲數(shù)與對(duì)照組的差異顯著。

圖1 不同時(shí)間內(nèi)各濃度茶皂素對(duì)甘薯小象甲的拒食率趨勢(shì)Fig.1 Trend of antifeedant rate of tea saponin in different concentrations to C. formicariusin different time

由生存曲線(圖2)趨勢(shì)可知，茶皂素對(duì)甘薯小象卵孵化期及幼蟲后期至化蛹期的生存影響較大，隨濃度的增大其影響作用也更明顯，在羽化后的試蟲中，CK的存活率為42.00 %，0.5 %和1.0 %茶皂素處理的存活率分別為35.00 %和22.00 %。

3 討 論

本研究中，茶皂素水溶液對(duì)甘薯小象甲既沒有嗅覺忌避作用，也沒有嗅覺引誘作用，可能是由于茶皂素在常溫下是一種難以揮發(fā)的物質(zhì)[15]，其飄散在空氣中的成分極少，不足以引起甘薯小象甲強(qiáng)烈的行為趨向，這有待進(jìn)一步驗(yàn)證。而茶皂素對(duì)甘薯小象甲具有明顯的取食忌避作用，忌避率隨茶皂素濃度升高而升高，隨時(shí)間增長而升高；飼喂6 h的試蟲忌避行為比1 h的試蟲更顯著，可見在更長的飼喂時(shí)間下甘薯小象甲對(duì)茶皂素更為敏感。相對(duì)于1 h時(shí)處于饑餓的狀態(tài)下的試蟲，6 h時(shí)的非饑餓狀態(tài)下的試蟲會(huì)對(duì)食物進(jìn)行更優(yōu)的選擇，因此對(duì)含茶皂素食物的選擇也相應(yīng)減少。此外，茶皂素對(duì)甘薯小象甲具有強(qiáng)烈的拒食作用，拒食率隨時(shí)間增長而升高，不具有急性毒性。這同樣表現(xiàn)在對(duì)菜青蟲拒食活性上，Cai等[16]采用葉牒飼喂法用500 mg/L茶皂素水溶液處理的芥藍(lán)葉牒飼喂5齡菜青蟲幼蟲，12 h后選擇性拒食率可達(dá)100 %，采用灌根寄主植物的方法，24 h后菜青蟲的拒食率達(dá)63.95 %。在茶皂素影響下甘薯小象甲的幼體發(fā)育歷期縮短，猜測(cè)茶皂素可能具有抗保幼激素活性。本研究中，茶皂素雖然沒有對(duì)甘薯小象甲的卵造成顯著傷害，但極大地縮短了卵的發(fā)育時(shí)間，這可能是由于茶皂素的早熟作用促進(jìn)了胚胎發(fā)育。當(dāng)進(jìn)入甘薯小象甲進(jìn)入幼蟲階段后，出現(xiàn)了59.22 %的死亡率，可能原因?yàn)椋孩僭缡炫咛シ趸唤】档挠紫x導(dǎo)致快速死亡；②抗性較強(qiáng)的幼蟲在攝入茶皂素后，引起的早熟作用使幼蟲出現(xiàn)不正常發(fā)育，導(dǎo)致提前轉(zhuǎn)齡和化蛹，或出現(xiàn)蛻皮障礙導(dǎo)致死亡。當(dāng)進(jìn)入蛹階段后，雖然甘薯小象甲在這一時(shí)期的抗逆性較強(qiáng)，但幼蟲時(shí)期產(chǎn)生的影響導(dǎo)致了蛹滯育，從而死亡。這種類昆蟲激素的抗蟲作用方式在常規(guī)試驗(yàn)中很難被發(fā)現(xiàn)，但不能排除其存在的可能性，且植物源藥劑的優(yōu)勢(shì)就在于其作用方式多樣化，其中潛在的抗蟲作用方式應(yīng)受到重視。有報(bào)道稱，茶皂素使小菜蛾蛹的發(fā)育歷期個(gè)體顯著延長[17]，也有研究表明茶皂素對(duì)茶尺蠖(Ectropisobliqua)3齡幼蟲、小菜蛾(Plutellaxylostella)2齡幼蟲、豆蚜(Aphiscraccivora)[18]、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)4齡和5齡幼蟲[19]具有較強(qiáng)的毒殺活性，這些結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相似，驗(yàn)證了茶皂素的抗蟲活性，下一步可對(duì)其作用機(jī)理開展深入研究。

圖2 在茶皂素影響下甘薯小象甲幼體的生存曲線Fig.2 The survival curve of the larvae of C. formicarius determined under the influence of tea saponin

4 結(jié) 論

茶皂素對(duì)甘薯小象甲沒有嗅覺忌避作用和嗅覺引誘作用，但具有明顯的取食忌避作用和強(qiáng)烈的拒食作用，但不具有急性毒性。在茶皂素影響下甘薯小象甲的幼體發(fā)育歷期縮短，且幼體可發(fā)生死亡。