基于ISSR分子標記技術的杏鮑菇種質資源評價

楊和川，蘇文英，譚一羅，秦裕營，馬 騰，浦漢春，周振玲

(連云港市農業(yè)科學院，江蘇 連云港 222006)

【研究意義】杏鮑菇(Pleurotuseryngii)又名刺芹側耳，隸屬于擔子菌門(Basidiomycota)、傘菌亞門(Agaricomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、傘菌目(Agaricales)、側耳科(Pleurotaceae)、側耳屬(Pleurotus)[1]。杏鮑菇營養(yǎng)豐富，其子實體的菌肉肥厚，口感極佳，兼具鮑魚口感和杏仁香味，深受廣大消費者的喜愛，是目前我國工廠化栽培的珍稀食用菌品種之一。但杏鮑菇子實體形態(tài)特征、生長周期及產量性狀等受外界環(huán)境因素影響較大，同一株菌株在不同栽培環(huán)境中子實體形態(tài)特征會產生較大的差異，且因為缺乏嚴格的菌種管理制度，使得“同種異名”現(xiàn)象廣泛存在，使杏鮑菇的遺傳育種研究工作難以開展，因此目前工廠化栽培的杏鮑菇品種十分單一，且生物轉化率比較低?！厩叭搜芯窟M展】ISSR(簡單序列重復區(qū)間擴增)標記技術是1994年由Zietkiewicz[2]等建立的一種分子標記技術，該技術是基于SSR(簡單重復序列)基礎上發(fā)展起來的。ISSR分子標記具有操作簡單、可重復性高、穩(wěn)定性好及變異位點豐富的特點，在食用菌品種鑒定及遺傳多樣性分析中得到廣泛的應用[3-6]。熒光毛細管電泳技術由于其自動化及分析精細的特點，被廣泛應用在作物的遺傳關系分析中[7-9]，與傳統(tǒng)的PAGE銀染法相比，其準確性和靈敏度具有更高的優(yōu)勢[10]。【本研究切入點】因此，本研究借助該項技術，通過體細胞不親和性、分子標記技術及農藝性狀的比較分析，詳細、系統(tǒng)的對杏鮑菇菌株進行種質資源的綜合評價?！緮M解決的關鍵問題】篩選出具有開發(fā)潛力的優(yōu)良菌株作為育種的試驗材料，為杏鮑菇育種手段和方法的深入研究和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株見表1，其中LX4為工廠化栽培品種。

1.1.2 培養(yǎng)基配方 PDA培養(yǎng)基(固體)：用于供試菌株的培養(yǎng)。將馬鈴薯去皮后稱取200 g，切成正方形小方塊，于電磁爐煮沸，過濾后加入20 g葡萄糖，10 g瓊脂粉，定容至1 L，pH自然，于121 ℃高壓滅菌。

MYG液體培養(yǎng)基：麥芽糖5 g，葡萄糖5 g，酵母浸粉10 g，瓊脂粉15 g，pH值自然，加水定容至1 L，121℃高壓滅菌30 min。

栽培種培養(yǎng)基：玉米芯25 %、木屑35 %、麥麩24 %、玉米粉10 %、豆粕4.5 %、石灰0.5 %、輕質碳酸鈣1 %。

1.1.3 試劑 10 × PCR Buffer(含 Mg2+)，dNTP，TaqDNA 聚合酶等試劑均由賽默飛世爾科技(中國)有限公司提供。

1.2 體細胞不親和性實驗

將27株供試菌株于25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d復壯后，用8 mm打孔器打孔隨機選取3個不同菌株的菌塊接種于同一MYG平板上，于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)10 d，此為1個處理，每個處理接種3個平板為3 次重復，觀察不同菌株菌落接觸部分的拮抗反應，將拮抗結果的有(+)、無(-)進行統(tǒng)計。

1.3 ITS分析

以ITS1和ITS4(表2)為引物對27個供試菌株進行 PCR 分析。反應總體系為50 μl: 10×PCR buffer(含 Mg2+) 10 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，TaqDNA 酶1 μl，F(xiàn) Primer 2 μl，R Primer 2 μl，模板 DNA 3 μl，ddH2O 31 μl；PCR 擴增程序：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，30 個循環(huán)，72 ℃延伸2 min。PCR擴增產物送金唯智(南京)測序。測序結果通過NCBI進行同源序列比較。

1.4 ISSR分析方法

本實驗所用引物選自哥倫比亞大學UBC公布的ISSR引物，并查閱了相關真菌方面的文獻，選擇了有普遍代表的20條引物進行篩選，淘汰無擴增產物和多態(tài)性差的引物，選留擴增條帶清晰且有明顯多態(tài)性片段的引物8個(表2)。利用這些ISSR引物對27個供試菌株進行 PCR 分析。PCR擴增體系總體積為：25 μl，10×PCR buffer(含 Mg2+) 2.5 μl，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，TaqDNA 酶0.5 μl，引物0.5 μl，模板 DNA 2 μl，ddH2O 19 μl。PCR 反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，45個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR樣品加入 ABI377 DNA 測序儀上進行毛細管電泳，測序儀激光管開始收集條帶。電泳結束后，打開膠圖，即可分析結果，將膠圖上出現(xiàn)DNA片段的計為1，不出現(xiàn)的計為 0，進行0～1數(shù)據(jù)統(tǒng)計，統(tǒng)計后輸入電腦，用NT-SYS聚類分析軟件體系進行聚類分析，并且構建遺傳相關聚類圖譜。

表1 杏鮑菇供試材料

表2 引物序列及編號

1.5 農藝性狀分析

將27株杏鮑菇菌株分別接種于MYG液體培養(yǎng)基中，于25 ℃培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)制備液體菌種，每個菌株24瓶，接種于栽培袋中25 ℃恒溫培養(yǎng)25 d，滿袋后生理后熟10 d，進行搔菌處理，然后將其轉移至14～16 ℃菇房中出菇。觀察菌絲生長情況，記錄滿袋時間、原基形成時間以及子實體成熟時間，統(tǒng)計分析商品性狀，包括菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄長度、子實體顏色以及產量。

2 結果與分析

2.1 體細胞不親和性實驗

27株供試菌株的拮抗反應結果見表3。由表3可知，LX2、LX21、LX24與其它菌株間有明顯的拮抗現(xiàn)象，表明這3個菌株與其他菌株間具有較遠的親緣關系，為不同品種的菌株。

2.2 ITS序列分析

PCR產物通過1 %的凝膠電泳檢測，得到清晰的目的條帶，見圖1。將27株供試菌株的PCR產物送金唯志測序，測序獲得的ITS序列與NCBI中的杏鮑菇菌種的ITS序列進行BLAST序列比對，這27株供試菌株的序列與NCBI中的杏鮑菇序列相似度在99 % 以上，因此，在種的水平上證明這27株供試菌株為杏鮑菇。

2.3 毛細管電泳檢測和擴增多態(tài)性分析

利用8 條引物對27株杏鮑菇菌株進行 PCR擴增，并對引物807的擴增片段進行了相關的數(shù)據(jù)分析(圖 2)，通過檢測發(fā)現(xiàn)引物807共擴增出條帶36條，其中多態(tài)性條帶34條，多態(tài)性比率94.4 %。剩余7個引物的毛細管電泳檢測圖片也具有較高的多態(tài)性。根據(jù)這些毛細管電泳檢測圖片，統(tǒng)計0～1數(shù)據(jù)表。將0～1數(shù)據(jù)用NT-SYS聚類分析軟件體系進行聚類分析，構建遺傳相關聚類圖譜，見圖3。當遺傳相似性系數(shù)為0.87時，27株杏鮑菇菌株分為4類，其中LX10、LX21各為單獨的1個類群，LX2、LX16、LX17為1個類群，其他菌株為1個大類群。當遺傳相似性系數(shù)為0.876時，LX2、LX16、LX17又分為2個亞類群，其中LX2為單獨的1個亞類群。

M:DNA分子量標準(100～2000 bp); 1～27: 供試樣品名稱(表 1)M: DNA marker (100-2000 bp); 1-27: The tested samples of P. eryngii(table 1)圖1 ITS擴增產物 Fig.1 ITS amplified products

M: ROX 紅色熒光標記的分子量標準(50～1000 bp); 1～27: 供試樣品名稱(表 1)M: ROX red fluorescent marker (500-1000 bp); 1-27: The tested samples of P. eryngii(table 1)圖2 引物807 ISSR 擴增 Fig.2 ISSR amplified products by primer 807

圖3 27個供試樣品的ISSR聚類分析Fig.3 ISSR clustering analysis of 27 tested samples

2.4 杏鮑菇農藝性狀評價

由表3可知，27株杏鮑菇菌株的生育期為 44～63 d，差異較大。根據(jù)生育期的長短，將生育期小于50 d的杏鮑菇，劃分為早熟品種；生育期 50～55 d的為中熟品種；生育期大于55 d的為晚熟品種。其中，LX4、LX21 和 LX24 為早熟品種，LX21的生育期為 44 d，其滿袋時間、原基發(fā)生時間以及子實體成熟時間均短于工廠化栽培品種LX4。LX3、LX6、LX8、LX10、LX16、LX20、LX23 為中熟品種，其它為晚熟品種。對27株杏鮑菇菌株的商品性狀統(tǒng)計如圖3、表4～5所示，27株杏鮑菇菌株在子實體大小、顏色等商品性狀方面差異較大，具有豐富的遺傳多樣性。菌蓋直徑在2.2～7.64 cm 之間；菌蓋厚度在0.97～2.88 cm 之間；菌柄長度在8.9～15.67 cm 之間。菌蓋顏色分為淺棕色、淡黃色及灰褐色。各菌株間商品菇單產產量有著明顯的差別。其中單產產量最高的菌株是杏鮑菇LX4，單個杏鮑菇產量達到197.5 g ，產量較低的是杏鮑菇LX2和LX16。菌株LX18雖然生育期時間較長，但其產量相對較高，并且其在生長過程中不易開傘；而菌株LX21雖然生育期最短，但是產量相對不高。因此，選擇LX18與LX21 這2個性狀優(yōu)良且互補的菌株作為雜交的親本，有利于培育出早熟、高產的優(yōu)質杏鮑菇雜交新品種。

表3 不同菌株菌絲間的拮抗作用

3 討 論

種質資源是遺傳育種的原材料，是檢測菌種質量好壞的重要因素，快速的菌種鑒定和保護為食用菌產業(yè)的良性發(fā)展奠定了基礎[11]。在本研究中，菌株LX2、LX21及LX24與其余菌株間均形成較為明顯的拮抗現(xiàn)象，表明這兩株菌株與其它菌株親緣關系較遠，但是拮抗現(xiàn)象結果的判定易受主觀因素影響，因此需要結合其他方法對杏鮑菇菌株的親緣關系進行分析。因此本研究進一步利用ISSR分子標記技術對27株杏鮑菇菌株進行了進一步研究，試驗結果表明，當遺傳相似性系數(shù)為0.87時，27株杏鮑菇菌株分為4類，其中LX10、LX21各為單獨的1個類群，LX2、LX16、LX17為1個類群，其他菌株為1個大類群。在拮抗實驗中LX10與部分菌株無明顯拮抗反應，但在ISSR分子標記中該菌株單獨為1個類群，說明ISSR分子標記比拮抗試驗更能精準反映菌株種間、種內的差異性。拮抗實驗結果中LX24與所有菌株均有明顯拮抗現(xiàn)象，但在遺傳相似性系數(shù)為0.87時，該菌株被歸為第1大類群，結果不一致，導致的原因可能是本研究中ISSR分子標記選取的引物數(shù)量較少，需要選取更多引物進行進一步驗證。從遺傳相關聚類圖譜中可以看出，那些來自于不同地區(qū)的杏鮑菇菌株也被聚集到一個類群，這或許是因為在長期的馴化栽培以及引種試種過程中，因缺乏嚴格的菌種管理制度，出現(xiàn)“異種同名、同種異名”的現(xiàn)象，使得各個杏鮑菇品種間的遺傳關系較小，本研究也從DNA水平證實了27株杏鮑菇菌株遺傳基礎比較集中。因此在以后的育種工作當中，親本的選擇應選用不同類群、遺傳距離較遠且綜合性狀優(yōu)良的菌種為親本，這樣才有利于下一步雜交選育獲得優(yōu)勢品種，擴大遺傳基礎。

圖4 27株杏鮑菇子實體形態(tài)特征Fig.4 Fruiting body morphological characteristics of P. eryngii

表4 杏鮑菇生育期評價

表5 杏鮑菇商品性狀比較

農藝性狀統(tǒng)計結果表明，不同子實體間的表觀特征差異較大，其中LX18為晚熟品種，產量較高，且不易開傘，LX21生長周期最短，但其在生長后期易開傘，產量不高，且根據(jù)拮抗試驗和分子標記結果表明這2種菌株親緣關系較遠，可作為雜交育種的親本，進一步培育開發(fā)早熟高產優(yōu)良的新菌株。王波[12]的研究也表明將分子標記技術與農藝性狀結果進行綜合分析，是確定進行雜交育種的親株，是獲得優(yōu)良菌株的有效方法。因此，本研究通過體細胞不親和性、分子標記技術及農藝性狀的比較分析，詳細、系統(tǒng)的對杏鮑菇菌株進行種質資源的綜合評價，全面準確的鑒定杏鮑菇菌株間的親緣關系，篩選出了具有開發(fā)潛力的優(yōu)良菌株作為下一步育種的試驗材料，為加快推進杏鮑菇雜交育種的順利進行打下堅實的基礎。