linc00152通過調(diào)控DNMT3A和DNMT3B促進人宮頸癌細胞生長與侵襲

(廣東省第二人民醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510317)

宮頸癌是女性最常見的癌癥類型之一，特別是在發(fā)展中國家。此外，宮頸癌也是導(dǎo)致女性癌癥死亡相關(guān)的第四大常見因素[1]。近年來宮頸癌的發(fā)病狀態(tài)呈年輕化趨勢，盡管早期癌癥患者可通過手術(shù)與放療等獲益，但仍有部分患者預(yù)后不良，大多死于轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)。因此，闡明宮頸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機制對促進新型治療策略的發(fā)展至關(guān)重要。

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)是一類長度超過200個核苷酸、有功能的非編碼RNA。多項研究報道lncRNA參與細胞多方面生物學(xué)狀態(tài)并且與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)，但只有少部分lncRNA的功能特點和分子機制得到證實。其中，linc00152由828個核苷酸組成，位于2p11.2染色體。最初在肝癌中被發(fā)現(xiàn)具有差異低甲基化狀態(tài)，并且被證實其通過多種機制來調(diào)節(jié)基因表達，包括表觀遺傳修飾[2]和lncRNA-miRNA[3]和lncRNA-蛋白質(zhì)相互作用[2]。多項研究已表明，linc00152在多種惡性腫瘤中，如胃癌[4]、膽囊癌[5]、腎透明細胞癌[6]表達上調(diào)并發(fā)揮癌基因樣作用。然而，linc00152在宮頸癌中的生物學(xué)功能及其機制尚不清楚。因此，linc00152在調(diào)控宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用亟待研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人宮頸癌細胞株SiHa和HeLa細胞以及人正常宮頸上皮細胞株End1/E6E7細胞購于中國科學(xué)院細胞庫，RNeasy Mini Kit購于Qiagen公司，Reverse Transcription Kit與SYBR Green染料購于Biorad公司，RNA抽提試劑盒購自美國Invitrogen公司。

引物序列：linc00152：5′-TTGATGGCTTGAACATTTGG-3′and5′-TCGTGA TTTTCGGTGTCTGT-3′；β-actin:：5′-TCACCAACTGGGACGACATG-3′and5′-GT C ACCGGAGTCCATCACGAT-3′，均由Qiagen公司合成，sh-linc00152、sh-control、si-DNMT3A、si-DNMT3B、si-control、Lipofectamine 2000、Transwell小室均購于美國Invitrogen公司，MTT購于美國Sigma公司，DNMT3A、DNMT3B和β-actin抗體以及二抗購于美國Santa Cruz公司。

1.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測linc00152的表達

培養(yǎng)SiHa、HeLa細胞以及End1/E6E7細胞，用RNA抽提試劑盒抽提三種細胞中的總RNA，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA存于-70 ℃。qRT-PCR擴增反應(yīng)體系包括2x QuantiTect SYBR Green PCRMaster Mix 10μL，10x miScript Universal Primer 2 μL，10x miScript Primer Assay2 μL，Template cDNA 1 μg，RNase-free water加至共20 μL。循環(huán)體系為：Cycle 1：37 ℃ 15 min，3個循環(huán)；Cycle 2：94 ℃ 5 sec，55℃ 5 sec，70 ℃ 5 sec，40個循環(huán)；Cycle 3：4 ℃ 5 sec，在CFX96實時熒光定量PCR系統(tǒng)上檢測。以β-actin為內(nèi)參，所測定的linc00152的相對表達量采用2-ΔΔCT法分析。

1.3 Western blot法檢測linc00152對DNMT3A和DNMT3B蛋白表達的影響

培養(yǎng)HeLa細胞，將sh-linc00152和sh-control轉(zhuǎn)染質(zhì)粒按轉(zhuǎn)染說明分別轉(zhuǎn)染于HeLa細胞中，細胞分為sh-linc00152和sh-control兩組，其中sh-control為對照組，轉(zhuǎn)染后細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收獲細胞。RIPA裂解細胞并提取兩組細胞總蛋白，用BCA法測定細胞的蛋白濃度，每組取等量樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉1h，加入DNMT3A、DNMT3B抗體或β-actin抗體，4 ℃過夜，TBST洗膜，加二抗孵育1h，洗膜，ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影，掃描圖片，并計算結(jié)果。

1.4 MTT實驗

培養(yǎng)HeLa細胞，將sh-linc00152、sh-control、si-DNMT3A、si-DNMT3B以及si-control轉(zhuǎn)染質(zhì)粒按轉(zhuǎn)染說明分別轉(zhuǎn)染于HeLa細胞中。細胞分為sh-linc00152、sh-control、si-DNMT3A、si-DNMT3B以及si-control組，其中sh-control組為sh-linc00152組的對照組，si-control組為si-DNMT3A和si-DNMT3B組的對照組。分別取上述五組HeLa細胞接種于96孔板中，每組設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)至臨近飽和，每孔加滅菌MTT液(5 mg/ml)20 μL，孵育4 h后取出，每孔中加入DMSO150 μL，低速振蕩10 min，選擇570nm波長在酶標儀上測定各孔吸光值，記錄結(jié)果，實驗重復(fù)3次。

1.5 Transwell侵襲實驗

細胞培養(yǎng)與分組同MTT實驗。在transwell小室中鋪加8μL稀釋好的基質(zhì)膠，過夜形成基質(zhì)膜。取100 μL即含1×105個細胞/ml的細胞稀釋液，接種于transwell小室上層，下腔加500 μL含20%FBS的培養(yǎng)液后，置于37 ℃溫箱中孵育36 h，取出，用棉簽擦棄小室上層未遷移的細胞，PBS液輕洗，4%多聚甲醛固定、結(jié)晶祡染色下層穿出細胞，PBS液洗，倒置，晾干。光學(xué)顯微鏡下觀察并攝相，隨機選取4個高倍視野進行細胞計數(shù)，取平均值，實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有結(jié)果均以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，當P<0.05時，為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸癌細胞中l(wèi)inc00152表達水平

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，人宮頸癌細胞株SiHa和HeLa細胞中l(wèi)inc00152的表達水平分別為(1.633±0.086，1.926±0.107)，與正常宮頸上皮細胞株End1/E6E7細胞的表達水平(0.426±0.068)比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。

圖1 qRT-PCR檢測linc00152的表達與End1/E6E7細胞相比，**P<0.01。

2.2 轉(zhuǎn)染sh-linc00152、si-DNMT3A和si-DNMT3B后HeLa細胞中l(wèi)inc00152、DNMT3A和DNMT3B的表達

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染sh-linc00152組HeLa細胞中l(wèi)inc00152的表達水平明顯低于sh-control組(圖2)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Western blot檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-DNMT3A、si-DNMT3B組HeLa細胞中DNMT3A和DNMT3B蛋白表達水平明顯低于si-control組(圖3)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果提示sh-linc00152、si-DNMT3A和si-DNMT3B均轉(zhuǎn)染成功。

圖2 Hela細胞中sh-linc00152表達與sh-control組相比，**P<0.01；

圖3 Hela細胞中DNMT3A和DNMT3B蛋白表達

2.3 linc00152對DNMT3A和DNMT3B蛋白表達的影響

研究顯示，DNMT3A和DNMT3B與宮頸癌的進展有關(guān)，且受非編碼RNA的凋控。為明確在宮頸癌細胞中l(wèi)inc00152對DNMT3A和DNMT3B蛋白表達的影響，采用Western blot檢測。結(jié)果顯示，在HeLa細胞中，sh-linc00152組DNMT3A和DNMT3B蛋白表達水平明顯低于sh-control組(圖4)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 DNMT3A和DNMT3B蛋白表達

2.4 linc00152對人宮頸癌細胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，在HeLa細胞中，sh-linc00152組、si-DNMT3A以及si-DNMT3B組HeLa細胞的OD值分別為(0.413±0.061，0.409±0.0531，0.407±0.048)，與sh-control組，si-control組相比(0.750±0.063，0.743±0.080)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖5)。提示在HeLa細胞干擾linc00152、DNMT3A以及DNMT3B表達能抑制HeLa細胞的增殖。

圖5 MTT法檢測細胞增殖能力與sh-control組，si-control組相比，*P<0.05。

2.5 linc00152對人宮頸癌細胞侵襲的影響

Transwell結(jié)果顯示，在HeLa細胞中，sh-linc00152組和si-DNMT3A以及si-DNMT3B組HeLa細胞穿過基質(zhì)膠的細胞數(shù)量分別為(65±5)、(71±4)、(73±5)，與sh-control組，si-control組(115±7)、(126±6)相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖5)。提示在HeLa細胞干擾linc00152、DNMT3A以及DNMT3B表達能抑制HeLa細胞的侵襲。

3 討 論

近年來，lncRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)功能及其分子機制已經(jīng)成為研究熱點。越來越多研究已經(jīng)證實了lncRNA參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]，如肝癌[8]、胃癌[9]、尿路上皮癌[10-11]，并在惡性腫瘤中表達失調(diào)及功能異常。在體外研究中顯示[12]，linc00152在胃癌細胞系中的表達明顯高于正常胃粘膜上皮細胞，在胃癌細胞中敲低其表達可抑制細胞增殖和克隆形成，可促進G1期細胞周期停滯、觸發(fā)晚期凋亡，抑制上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與細胞的遷移與侵襲。研究表明[13]，在肝癌MHCC-97H細胞株中，linc00152的轉(zhuǎn)錄本主要存在細胞核中，且linc00152在體外可促進細胞增殖，在體內(nèi)可促使腫瘤生長。此外，微陣列分析顯示，linc00152通過與上皮細胞粘附分子(EpCAM)啟動子結(jié)合可以激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑，從而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、分裂以及腫瘤的發(fā)生。Cai等[5]證實，在膽囊癌中，linc00152明顯促進癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移與抑制凋亡。Wu等[6]研究發(fā)現(xiàn)在腎癌細胞系中l(wèi)inc00152表達上調(diào)不僅能促進細胞增殖與侵襲，還能抑制G1期細胞周期阻滯并抑制細胞凋亡。本次研究通過采用qRT-PCR技術(shù)在宮頸癌細胞與正常宮頸細胞中檢測發(fā)現(xiàn)，linc00152在宮頸癌細胞中的表達明顯高于正常宮頸細胞，與上述研究相符。進一步通過MTT實驗、Transwell實驗研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌細胞中敲低linc00152的表達能明顯抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲，表明linc00152在宮頸癌中發(fā)揮癌基因樣作用。

圖6 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力與sh-control組，或si-control組相比，**P<0.01。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)是一類參與DNA甲基化的酶，通過影響DNA甲基化，在多種生命活動進程中發(fā)揮重要作用，如染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)控、X染色體的失活和基因組的穩(wěn)定[14]。哺乳動物中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族可分為：DNA甲基化維持酶(DNMT1)以及DNA從頭甲基化酶(DNMT3A和DNMT3B)。目前，隨著對表觀遺傳學(xué)的深入研究，DNA甲基化在轉(zhuǎn)錄沉默和抑癌基因功能丟失中發(fā)揮重要作用[15]。無論基因組DNA過甲基化或去甲基化均可能導(dǎo)致抑癌基因的突變或改變其轉(zhuǎn)錄過程，進而引起細胞表型的改變。近年來，DNA異常甲基化與惡性腫瘤之間的相關(guān)性也引起了眾多學(xué)者的關(guān)注，并獲得了一些進展。研究證實DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)在多種惡性腫瘤，如胃癌[16]、肝癌[17]、肺癌[18]中表達增加。DNMT3A和DNMT3B與宮頸癌的進展有關(guān)[19]。此外，非編碼RNA在哺乳動物中調(diào)控DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的重要作用已被證實，同時已有相關(guān)調(diào)控機制的研究[20]。同樣地，在本研究中，我們觀察到在宮頸癌細胞中敲低linc00152可顯著抑制DNMT3A和DNMT3B表達。本研究還觀察到在宮頸癌細胞中敲低DNMT3A和DNMT3B后亦能抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲。

綜上所述，linc00152在宮頸癌細胞中表達增高且抑制linc00152的表達，能夠抑制宮頸癌細胞增殖與侵襲，其作用可能是通過調(diào)控DNMT3A和DNMT3B信號通路發(fā)揮的。這些結(jié)果為linc00152參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的可能分子機制提供了一個新的思路，linc0015也有望成為宮頸癌患者潛在的治療靶點。