基于脂肪酸分析的中國南方沼蛤食性研究

董浩韜 杜至力 張銳堅 劉穎詩

摘要：沼蛤（Limnoperna fortunei）作為亞洲地區(qū)淡水環(huán)境中主要的土著雙殼貝類群之一，其濾食生理活動對水環(huán)境產(chǎn)生重要的影響。本研究以沼蛤以及浮游生物（plankton）、懸浮有機顆粒（POM）和沉淀有機顆粒（SOM）為研究對象，檢測以上研究對象的脂肪酸標志物，分析沼蛤可能的食物來源。根據(jù)脂肪酸標志物檢測結(jié)果，沼蛤主要攝食綠藻綱（Chlorophyceae）、隱藻綱（Cryptophyceae）、甲藻綱（Dinophyceae）、細菌和陸源有機物。

關鍵詞：沼蛤;食性分析;脂肪酸

中圖分類號： X174 文獻標識碼：A 文章編號：2095-672X（2019）05-0-04

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2019.05.064

Abstract：Limnoperna fortunei （L. fortunei ） is one of the most abundant freshwater bivalves in southeast Asia， with wide-ranging direct and indirect impacts on ecosystems. To estimate material flows in the habitats of L. fortunei， a fatty-acid analysis was applied to assess the feeding spectrum of L. fortunei in southern China. Based on the fatty acid data， it was estimated that L. fortune consumed or selectively accumulated Chlorophyceae， Cryptophyceae， Dinophyceae， bacteria and terrestrial organic matter.

Keyword：Limnoperna fortunei;Feeding ecology;Fatty acid

沼蛤（Limnoperna fortunei），同種異名湖沼股蛤（Limnoperna lacustris），又稱金貽貝（Golden mussl）、淡水殼菜，是一種亞洲淡水貽貝，屬軟體動物門（Mollusca），雙殼綱 （Bivalvia），貽貝科（Mytilidae），股蛤?qū)伲↙imnoperna）[1]。沼蛤原產(chǎn)于東南亞地區(qū)的淡水河流和湖泊中，曾入侵香港的原水供水系統(tǒng)，其在管道及泵房造成生物污損密度達每平方米11，000個[2]。由于沼蛤具有很強的適應性和群集性，沼蛤的侵入影響原有水生食物鏈的平衡，并改變原水體中的底棲生物群落結(jié)構(gòu)。

沼蛤以濾食懸浮物為主，而懸浮物則主要來自水層和底質(zhì)，包括各種粒徑大小的浮游生物、水底再懸浮的有機質(zhì)、礦物碎屑以及微生物等[3-5]。其中，礦物碎屑往往又是浮游生物、藻類、原生動物和細菌等有機質(zhì)的載體[6]。水環(huán)境中有機質(zhì)來源的多樣性導致了沼蛤食物來源組成復雜。目前，本地區(qū)對沼蛤的研究集中在其作為生物污損物種的生理習性和治理[7]等方向，而對它的食性分析及其對浮游生物的影響則較少。

近年來，脂肪酸標志法在研究雙殼貝類食物來源的領域中得到應用。例如，許強[8]分析了相孔扇貝、紫貽貝和長牡蠣的食物來源;高菲等[9]分析了刺參的食物來源，還有姜緒[10]研究了蝦夷扇貝食物來源對生長和呼吸代謝的影響。因此，脂肪酸標志法可為研究確定沼蛤的食物組成并進一步了解它們的攝食傾向提供新的途徑。本研究選擇原水管中附著生長的沼蛤為研究對象，應用脂肪酸標志法分析沼蛤可能的食物來源。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和預處理

研究所用plankton樣本、POM樣本和SOM樣本于2016年3 - 11月期間每月取自廣東西江流域（23°08′12″N，112°48′7″E，地理位置如圖1所示）。采樣點水質(zhì)長期屬于 I 類地表水。采用孔徑為60 ?m的浮游生物網(wǎng)于水深2 - 8m，在垂直方向反復多次拖網(wǎng)采集plankton樣本。采集30 L淡水并分裝存于經(jīng)酸洗預處理的聚乙烯瓶中，用于過濾分離提取POM樣本。使用沉淀顆粒采集器（直徑為300 mm，PC-300， Mooring Systems Inc.， Cataumet， MA）于8 - 10m水深處采集SOM樣本。在采集上述樣本的同時，用深潛的方式采集河床深度為2 - 10m的沼蛤樣本（體長 ≥ 22 mm）。所有樣本采集后需迅速存于4℃冷藏環(huán)境中，然后運至實驗室進行預處理。

上述樣本在檢測之前均需進行預處理。plankton樣本首先進行冷凍干燥，然后研磨成粉末裝在經(jīng)酸洗預處理的聚乙烯袋中-80℃保存;用于過濾提取POM的水樣，首先采用孔徑為200 ?m的篩網(wǎng)去除大顆粒物，然后再用玻璃纖維濾膜過濾，用超純水洗出過濾物，冰凍干燥并裝在經(jīng)酸洗預處理的聚乙烯袋中-80℃保存;SOM樣本首先進行冰凍干燥，然后用300 ?m的鋼篩網(wǎng)去除大顆粒物，并裝在經(jīng)酸洗預處理的聚乙烯袋中-80℃保存;在提取消化腺組織之前，沼蛤樣本需采用經(jīng)過濾的河水培養(yǎng)24h，然后采用塑料刀解剖，所得的消化腺組織最后用超純水超聲清洗。10個沼蛤樣本的消化腺組織為一個待測樣本，每個待測樣本首先冰凍干燥，并裝在經(jīng)酸洗預處理的聚乙烯袋中-80℃保存。

1.2 脂肪酸標志法

脂肪酸分析所用器具均為玻璃制品，使用前用需450℃灼燒4h除去干擾物。脂肪酸分析操作參考Parrish[11]和許強[8]等人的研究，主要步驟包括：總脂抽提、脂族分離（僅用于沼蛤樣本）、脂肪酸甲酯（FAME）制備與純化和氣相色譜分析。

1.2.1 總脂抽提

用研缽磨碎凍干組織成粉狀，稱取0.5 g樣本加入離心管，加入10 mL二氯甲烷/甲醇（2：1，v/v）混合液;加入2.5 mL超純水，漩渦混合30 s，超聲（冰?。┨崛? min;3000rpm×5min離心分層;雙吸管吸出下層二氯甲烷相至稱重小瓶;離心管中加入二氯甲烷5 mL，重復提取一次;吸出下層相，和第一次提取合并;40℃水浴N2吹干總脂，稱重得到總脂肪重量;加入0.5 mL二氯甲烷重溶，總脂4℃冷藏待分析。

1.2.2 脂族分離

配制正己烷/無水乙醚/乙酸（90：10：1，v/v）展層劑50ml，加入雙槽層析缸中;用移液槍吸取總脂樣本在硅膠G層析板上劃線點樣，每板4個樣，并同時點TAG標準品。N2吹干溶劑;層析板放入層析缸中，每次兩個板;吹干溶劑后噴4% I2-甲醇溶液顯色，對照標準品位置切下黃褐色TAG部分轉(zhuǎn)移至10 mL玻璃試管中，加入3 mL二氯甲烷，漩渦混合30 s提取，2500rpm×5min離心，取上清液至稱重小瓶，40℃水浴N2吹干;加入1 mL二氯甲烷重浴。

1.2.3 脂肪酸甲酯（FAME）制備與純化

吸取含脂量1-5mg的脂肪樣本至色譜瓶，N2吹干溶劑，加入500 μL正己烷，充入N2氣擰緊蓋子震蕩，80℃×2h水浴;取出后置冷水浴中冷卻，加入250μL正己烷和125μL超純水，充分震蕩提取FAME;靜置或1500rpm×5min離心加速分層，吸取上層相至小試管，下層相重復加入500μL正己烷提取一次，上層相則與第一次提出合并;上層相N2濃縮至200μL左右;短滴管塞入棉花團，稱0.5g柱層析硅膠裝柱至滴管高度的一半，一倍柱體積二氯甲烷和正己烷/乙醚（95：5）分別沖柱后上樣，兩倍柱體積正己烷/乙醚（95：5）洗脫，洗脫液收集至10 mL試管中;40℃水浴N2濃縮至500μL，轉(zhuǎn)移至2 mL色譜瓶中，繼續(xù)濃縮至合適體積，充入N2氣置于-20℃保存待分析。

1.3 氣相色譜分析

儀器為島津GC-9A氣相色譜儀，色譜柱為DB-FFAP毛細管色譜柱。進樣體積1μL。載氣用氫氣，流速1.5mL/min。進樣口溫度250℃。單個色譜峰對照Cod Liver Oil（Sigma Co.，USA）標準品定性。對所有出峰進行面積歸一化后確定每種脂肪酸在總脂中的相對百分含量[12-13]。

根據(jù)沼蛤可能獲取的食物來源[3，4，6，14]，本節(jié)試驗選取以下幾種脂肪酸作為其各主要食物來源的標志（見表1）：

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件（版本號19.0）。脂肪酸標志物數(shù)據(jù)的分析，統(tǒng)計了平均值和標準差，并采用LSD（Fishers least significant difference）方法分析最小顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪酸標志物檢測結(jié)果

plankton、POM、SOM和沼蛤樣本的脂肪酸組成見表2。在飽和脂肪酸（SFAs）中，SOM的飽和脂肪酸（SFAs）相對比例最高（49.73%），其后從高到低依次為POM、plankton和沼蛤。C14：0、C16：0和 C18：0是各樣本的SFAs主要標志物，但相對比例存在顯著差異（P < 0.05）。各樣本的單一不飽和脂肪酸（MUFAs）相對比例為21.85% - 29.99%，其中主要標志物為C16：1（n-7 + n-9）、 C18：1（n-7）、 C18：1（n-9）、 C20：1（n-9） 和C22：1（n-9）。在個樣本的MUFAs中，C18：1（n-7）和C20：1（n-9）是沼蛤的主要脂肪酸標志物，而plankton、POM和SOM的主要脂肪酸標志物則為C16：1（n-7 + n-9） and C22：1（n-9）。各樣本的多元不飽和脂肪酸（PUFAs）相對比例為11.23% - 33.93%，其中SOM的PUFAs相對比例最低，而沼蛤的PUFAs相對比例最高。在支鏈飽和脂肪酸（BrFAs）中，各樣本均含有15-iso、16-iso、16-anteiso和17-iso等主要標志物， SOM的15-iso和17-iso相對比例明顯高于其他樣本。

參考表1的生物脂肪酸標志物，以判斷沼蛤的攝食傾向。沼蛤樣本中含有較高的隱藻脂肪酸標志物（C18：4（n-3）、C20：5（n-3） 和 C22：6（n-3），圖2 （b））和甲藻脂肪酸標志物（C18：4（n-3）、 C22：6（n-3）、C16：1 （n-7）/C16：0 = 0.19、DHA/EPA = 1.28，圖2（c））。相較之下，plankton、POM和SOM的生物脂肪酸標志物，則主要為綠藻（C18：3（n-3）和C16：4（n-3），圖2 （a））、硅藻（C16：2（n-4）、C16：3（n-4）、C16：1（n-7）/C16：0 = 0.19、DHA/EPA = 1.28，圖2 （d））、藍藻（C18：3（n-3），圖2 （e））、腐殖質(zhì)（C18：0）和植物碎屑（C20：0和C22：0，圖2 （g））。

2.2 結(jié)果討論

從圖2的脂肪酸比例組成可知，plankton、POM和SOM樣本的脂肪酸比例組成存在顯著差異，其中，plankton樣本主要組成物為綠藻、隱藻、硅藻和藍藻;POM主要組成物為植物碎屑;SOM主要組成物為異養(yǎng)細菌和橈足類。盡管plankton的脂肪酸標志物包含了綠藻、隱藻、硅藻和藍藻等藻類，但其相對比例較低，而POM中藻類的相對比例也比較低。POM和SOM中含有較高比例的SFAs （C18：0， C20：0 and C22：0）和BrFAs，代表植物碎片、生物假糞、生物排泄物和軟體動物分泌物是POM和SOM的主要組成物質(zhì)[15]。

不同類型的淡水貽貝其脂肪酸標志物組成存在顯著差異。與斑馬紋貝（D. polymorpha）相比[15]，C20：5（n-3）和C22：6（ n-3）在沼蛤中占比較高。此外，有研究指出，C22：6（n -3）與C20：4 （n-6）的比值影響水生生物的繁殖和生長[16]。斑馬紋貝的C22：6（n -3）與C20：4 （n-6）比值約為1.44[15]，而黑龍江河蘭蛤（Potamocorbula amurensis）C22：6（n -3）與C20：4 （n-6）的比值則為2（Canuel et a l. 1995）。在本研究中，沼蛤的C22：6（n -3）與C20：4 （n-6）的比值（2.02，見表2）高于斑馬紋貝和黑龍江河蘭蛤。

有研究指出[17-18]，貽貝主要攝食藻類并通過消化腺將藻類異化為主要代謝能源。如圖2a所示，C18：2（n-6）主要是經(jīng)由藻類合成的脂肪酸[19]，但其在沼蛤體內(nèi)的相對比例高于plankton、POM和SOM;同樣地，C18：4（n-3）作為隱藻和甲藻的脂肪酸標志物[20]，其在沼蛤體內(nèi)的相對比例也高于plankton、POM和SOM。其原因可能在于，沼蛤攝食綠藻、隱藻和甲藻等，并選擇性地吸收或積累C18：2（n -6） and C18：4（n-3）在體內(nèi)。相比較之下，硅藻（圖2 a）在plankton、POM和SOM的相對比例則高于沼蛤。然而，Gladyshev等人[18]指出，大部分貽貝會選擇性地攝食并將硅藻異化為甘油酯，以此作為代謝能源，但本研究未從脂肪酸標志物的數(shù)據(jù)中證實這個觀點。

Nichols等人[21]指出，部分貽貝可從異養(yǎng)微生物攝取并積累碳源和氮源。不同種類的微生物其代表脂肪酸標志物存在顯著差異[22]，例如i17：0和17： 0代表硫酸鹽還原微生物，而C18：1（n-7）則代表藍細菌、硫氧化微生物和好氧微生物。因此，本研究中沼蛤主要是攝食藍細菌、硫氧化微生物和好氧微生物等。由于plankton、POM和SOM中腐殖質(zhì)、植物碎屑和橈足類的脂肪酸標志物相對比例高于沼蛤，故此推斷沼蛤不偏好攝食腐殖質(zhì)、植物碎屑和橈足類。由于沼蛤的陸源有機物脂肪酸相對比例較高（見表2），因此Gladyshev等人[18]認為沼蛤是通過攝食異養(yǎng)微生物間接吸收積累陸源有機物，或是利用纖維素酶和半纖維素酶直接同化陸源有機物。

3 結(jié)論

本研究探討了中國南方沼蛤的攝食特征，通過脂肪酸標志物檢測，在沼蛤消化腺上檢測到綠藻、隱藻、甲藻、異養(yǎng)細菌和陸源有機物等脂肪酸標志物，根據(jù)上述物質(zhì)在沼蛤體內(nèi)的相對比例，判斷沼蛤主要攝食藻類、異養(yǎng)微生物和陸源有機物。

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收稿日期：2019-03-18

作者簡介：杜至力（1986-），男，碩士，工程師，研究方向為水污染控制。