BMS-345541對哮喘小鼠氣道重塑和氣道上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用

于 洋,王 力,竇 晶

(大連市第五人民醫(yī)院呼吸科,大連 116000;*通訊作者,E-mail:2910938486@qq.com)

哮喘的特征是可逆性氣流阻塞、氣道高反應(yīng)性(airway hyperresponsiveness,AHR)、氣道炎癥、氣道重塑、黏液分泌亢進(jìn)和氣道上皮下纖維化[1-3]。哮喘發(fā)病機(jī)制的一個重要環(huán)節(jié)是氣道重塑引發(fā)的損傷,即上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[4,5]。EMT指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程。EMT降低了氣道上皮細(xì)胞進(jìn)行藥物治療的靈敏度,從而減少了糖皮質(zhì)激素治療重癥哮喘糖尿病患者的療效。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)是參與介導(dǎo)氣道重塑的重要細(xì)胞因子[6-8]。TGF-β誘導(dǎo)的EMT由NF-κB依賴性細(xì)胞信號傳導(dǎo)[9-11]。NF-κB信號通路的IKKβ的抑制劑BMS-345541[(2′-氨基乙基)氨基-1,8-二甲基咪唑并(1,2-a)喹喔啉]具有100%口服生物利用度和2.2 h的靜脈半衰期,故該藥適合用于研究IKKβ抑制劑在疾病模型中的應(yīng)用[12,13]。核因子抑制劑IKKβ可以弱化由促炎細(xì)胞因子和TLR3受體激動劑所引起的上皮細(xì)胞合成能力的激活,故核因子抑制劑IKKβ可能為支氣管哮喘的治療提供一個重要的新方法[14]。故本研究通過對不同模型小鼠(對照組、哮喘模型組、BMS組)血清和BALF中的TGF-β1濃度、E-鈣黏蛋白和波形蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄水平、EMT調(diào)節(jié)劑E-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)水平等指標(biāo)的分析,探索BMS-345541對哮喘小鼠氣道重塑和氣道上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級C57BL/6J 6-7周齡小鼠48只,體質(zhì)量(18±2)g,購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,由大連中心醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心自養(yǎng)21 d。屏障系統(tǒng)動物房,溫度(25±2)℃,相對濕度50%-60%,每天12 h(8:00-20:00)照明。動物實(shí)驗(yàn)的操作與處理由大連中心醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心動物保健與使用委員會批準(zhǔn),遵循實(shí)驗(yàn)動物倫理要求。

1.2 主要試劑與儀器

BMS-345541(美國sigma試劑公司);OVA(美國sigma試劑公司);氫氧化鋁(上海碧云天公司);小動物呼吸機(jī)(瑞沃德動物實(shí)驗(yàn)儀器公司);E-鈣黏蛋白和波形蛋白mRNA試劑盒(上海碧云天公司)。

1.3 小鼠哮喘模型建立

使用卵清蛋白(OVA)在氣道重塑和氣道上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中建立小鼠哮喘模型,SPF級C57BL/6小鼠48只隨機(jī)分為3組,包括對照組(n=16,不做任何處置)、哮喘模型組(n=16)、BMS組(n=16,哮喘模型同時腹腔注射BMS-345541)。

1.4 小鼠哮喘癥狀嚴(yán)重程度和氣道反應(yīng)性的測定

對所有小鼠稱重,小鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉,完全暴露頸部氣管,通過氣管切開術(shù)插入氣管導(dǎo)管(內(nèi)徑2 mm),將氣管導(dǎo)管連接到小動物呼吸機(jī)裝置,機(jī)械通氣,潮氣量為0.2 ml,頻率為140次/min。在呼吸機(jī)、PBS和一系列增加劑量作用下平衡5 min,小鼠腹腔注射不同濃度的(3,6,12 mg/ml)乙酰膽堿(acetylcholine,ACH)后,通過傳感器收集小鼠表現(xiàn)出的多樣性哮喘癥狀并加以評估。另將小鼠注射OVA,15 min后,測量肺阻力(RL)以評估AHR的變化。

1.5 ELISA法測定血清和BALF中的TGF-β1濃度

造模干預(yù)后第2周,通過尾靜脈采集外周血0.5 ml,用TGF-β1 ELISA試劑盒測量血清和BALF中的TGF-β1的濃度。微孔板檢測光學(xué)密度(OD),通過OD值確定TGF-β1水平。

1.6 肺組織病理學(xué)

石蠟包埋的部分用蘇木精和伊紅(H&E)染色觀察氣道重塑的變化,進(jìn)行高碘酸-希夫(PAS)染色。染色步驟:切片脫蠟至水;高碘酸液處理5-10 min;流水沖洗5 min,擦干切片上多余水分;滴加Schiff染液,染色10-15 min;流水清洗5-10 min;Mayer蘇木素復(fù)染;分化、水洗;返藍(lán)、水洗;常規(guī)脫水,二甲苯透明;中性樹膠封片;顯微鏡觀察結(jié)果:糖原、中性黏液物質(zhì)呈紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)色,使用尼康dS-Ri2數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍攝圖像。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR法測定E-鈣黏蛋白和波形蛋白mRNA水平

取肺組織,勻漿后采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,分別在280 nm波長和260 nm波長測定吸光度,計(jì)算RNA原液濃度和OD260/OD280。根據(jù)RNA原液濃度以及試劑盒說明調(diào)整RNA濃度,使RNA稀釋液濃度為500 ng/μl。按E-鈣黏蛋白和波形蛋白mRNA試劑盒要求配制反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為:37 ℃孵育15 min;于85 ℃加熱5 s以終止反應(yīng),合成的cDNA保存于-20 ℃。RT-PCR反應(yīng)體系包括：Forward Primer(5 μmol/L)1 μl、Reverse Primer(5 μmol/L)1 μl、2×GoldStar Best MasterMix10 μl、Template DNA 1 μl、RNase-Free Water 7 μl。PCR條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃ 40 s，分別采用上述5個Tm溫度退火30 s，72 ℃延伸3 min，10個循環(huán)；退火溫度和時間不變，延伸時間每循環(huán)遞增30 s，20個循環(huán)。根據(jù)第一次反應(yīng)結(jié)果重新調(diào)整Tm值區(qū)間，在64-72 ℃之間設(shè)置6個溫度的Tm值，分別為64,66.3,67.5,68.8,70,72 ℃，篩選最佳反應(yīng)溫度再進(jìn)行PCR反應(yīng)。定量分析細(xì)胞中E-鈣黏蛋白和波形蛋白mRNA含量。引物序列(5′-3′)：TGF-β1上游引物CCAGTCGAACTGACTAGCGCA，下游引物GCCAGCTCGTGACGCGTCAGC；GADPH上游引物CGCGACGCACCATCGCACGAG，下游引物GACGCAGATCACTCAGTGCCAG。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。實(shí)時熒光定量PCR引物序列結(jié)果以2-ΔΔCt表示。計(jì)算公式如下：ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組。

1.8 蛋白質(zhì)印跡分析E-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)

使用RIPA從肺組織中提取總蛋白裂解緩沖液。使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒對蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測定,15% SDS-PAGE(50 μg/泳道)分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。含5%非脂肪牛奶在室溫下放置1 h,然后在4 ℃過夜孵育抗E-cadherin(1 ∶1 000)和抗vimentin(1 ∶1 000)的抗體、β-肌動蛋白抗體(1 ∶2 000),用HRP偶聯(lián)的二級探針探測膜抗體(1 ∶3 000)在室溫下孵育2 h,用ECL試劑顯示。使用Image6.0軟件半定量分析E-鈣黏蛋白和波形蛋白的相對表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件(美國IBM公司);計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析或者重復(fù)測量的方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用百分率(%)表示,組間比較采用χ2分析;P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMS-345541對OVA誘導(dǎo)的癥狀的影響

哮喘模型組小鼠表現(xiàn)出多樣性哮喘癥狀,包括煩躁不安,呼吸短促和不規(guī)則呼吸節(jié)律,咳嗽,抓鼻子,抓耳,萎縮,前肢抬起,活動減少。使用BMS-345541干預(yù)后BMS組小鼠哮喘癥狀減輕。對照組小鼠未表現(xiàn)出哮喘發(fā)作或過敏癥狀。

2.2 BMS-345541對肺阻力的影響

與對照組相比,哮喘模型組和BMS組肺阻力呈上升趨勢,且隨著藥物劑量的增大而增大。隨著BMS組中BMS-345541的加入,肺阻力逐漸有所緩解(P<0.05,見表1),且與作用劑量成正比。

表1 BMS-345541對肺阻力的影響cmH2O/(ml·s)

Table 1 Effects of BMS-345541 on pulmonary resistancecmH2O/(ml·s)

組別n3 mg/ml6 mg/ml12 mg/ml對照組162.35±0.472.87±0.313.22±0.73哮喘模型組163.71±0.34a7.64±0.53a13.08±1.03aBMS組162.92±0.51ab3.68±0.94ab6.57±0.73ab F13.32910.29720.771 P0.0010.0010.001

與對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05

2.3 BMS-345541對氣道重塑的影響

PAS染色用于評估細(xì)胞增生和黏液產(chǎn)生對氣道重塑的影響,結(jié)果見圖1。與對照組相比,哮喘模型組小鼠氣道重塑與對照組相比,基底膜增大增厚,杯狀細(xì)胞增生,黏液分泌過多,上皮損傷增加(見圖1B)。使用BMS-345541處理后,基底膜厚度減小,杯狀細(xì)胞增生減少,黏液分泌量減少,上皮損傷程度減小,嗜酸性粒細(xì)胞百分比下降(見圖1C)。

圖1 BMS-345541對氣道重塑的影響 (×100)Figure 1 Effects of BMS-345541 on airway remodeling (×100)

2.4 BMS-345541對血清和BALF中TGF-β1濃度的影響

與對照組相比,哮喘模型組和BMS組的蛋白表達(dá)水平升高,血清和BALF中TGF-β1濃度增加。隨著BMS-345541的加入,BMS組與哮喘模型組相比,TGF-β1濃度呈現(xiàn)下降趨勢(P<0.05,見表2)。

Western blot結(jié)果顯示,肺組織中TGF-β1表達(dá)哮喘組較對照組高，BMS組較哮喘模型組低(見圖2)。肺組織中的TGF-β1表達(dá)對照組為(952.76±852.06)pg/ml，哮喘模型組為(1 523.85±138.96)pg/ml，BMS組為(1 099.62±105.35)pg/ml;三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36.922,P=0.001)。

2.5 實(shí)時熒光定量PCR法測定各組小鼠肺組織mRNA相關(guān)基因表達(dá)情況

與對照組比較,哮喘模型組和BMS組小鼠細(xì)胞中TGF-β1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平增加(P<0.05)。

表2 BMS-345541對血清和BALF中的TGF-β1濃度的影響(pg/ml)

Table 2 Effect of BMS-345541 on serum and BALF levels of TGF beta 1(pg/ml)

組別n血清BALF對照組1631.58±13.4221.94±12.11哮喘模型組1684.37±36.28a45.37±11.96aBMS組1646.04±26.83ab27.41±16.35ab F26.30725.787 P0.0010.001

與對照組比較,aP<0.05;與哮喘模型組比較,bP<0.05

圖2 Western blot檢測BMS-345541對肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)水平的影響Figure 2 Effect of BMS-345541 on the expression of TGF beta 1 protein in lung tissues by Western blot

與哮喘模型組相比,BMS組小鼠細(xì)胞中由于BMS-345541的加入,基因表達(dá)被抑制,下調(diào)較為顯著(見圖3)。對小鼠組織提取RNA,并使用轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Invitrogen)將SuperScript Ⅱ Reverse逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,包含外顯子4-8的381 bp cDNA片段的PCR。結(jié)果顯示，小鼠肺組織中TGF-β1 mRNA基因轉(zhuǎn)錄水平對照組為0.67±0.08,哮喘模型組為0.97±0.11,BMS組為0.82±0.08;三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.309,P=0.001)。

圖3 RT-PCR檢測基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平Figure 3 Detection of gene transcription by RT-PCR

3 討論

哮喘是一種慢性炎癥性疾病,哮喘的易感因素和發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。本研究使用OVA建立小鼠哮喘模型,對BMS-345541抑制OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠進(jìn)行治療觀察,研究哮喘小鼠氣道重塑和氣道上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制。EMT異常是哮喘病理生理學(xué)的核心原因[15,16]。EMT的變現(xiàn)包括E-cadherin表達(dá)下降,波形蛋白的表達(dá)增加以及從上皮細(xì)胞到間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變[17-19]。本研究證實(shí)BMS-345541具有有效的抗哮喘作用。

與對照組相比，哮喘模型組小鼠嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量增加，肺組織表現(xiàn)出氣道重塑，包括氣道平滑肌基底部擴(kuò)大，膜增厚，上皮損傷，纖維化，杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌過多，這表明氣道重塑成功地在OVA誘導(dǎo)的小鼠模型中被建立。哮喘慢性炎癥引起的TG-Fβ1分泌增加可能導(dǎo)致EMT，這是氣道炎癥和氣道重塑中最重要的機(jī)制。E-鈣黏蛋白和波形蛋白是EMT的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。E-鈣黏蛋白的喪失可破壞支氣管上皮屏障功能，導(dǎo)致支氣管上皮失去其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和極性。本研究發(fā)現(xiàn)，OVA哮喘模型組中E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)和波形蛋白表達(dá)上調(diào)，這些結(jié)果證實(shí)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT在氣道重塑中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果還顯示OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠存在明顯的EMT相關(guān)的氣道重塑，BMS-345541能抑制小鼠哮喘的EMT過程，減輕氣道炎癥與損傷，通過調(diào)節(jié)EMT蛋白E-Cadherin和Vimentin的表達(dá)變化從分子水平調(diào)控EMT，從而達(dá)到治療哮喘的作用。此外，NF-κB活性與哮喘炎癥EMT發(fā)生相關(guān)，抑制NF-κB通路活性可抑制TGF-β1誘導(dǎo)哮喘小鼠EMT的發(fā)生，抑制NF-κB通路可減輕哮喘小鼠氣道過敏性炎癥。

綜上所述，OVA 哮喘小鼠存在EMT氣道重塑；而BMS-345541可能會通過改變哮喘小鼠氣道重塑和氣道上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減輕氣道重塑，抑制EMT，從而減輕小鼠的哮喘反應(yīng)。但由于藥物對于機(jī)體的治療作用機(jī)制十分復(fù)雜，BMS-345541是否通過其他分子通路起作用還需進(jìn)一步研究。