超聲輻照聯(lián)合靜脈輸注微泡對大鼠急性心肌梗死微循環(huán)的改善作用

高彥霞,賀文婷,秦署光,張 瑞,朱 丹,李麗君#,潘龍飛*

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科,西安 710004;2西安市第四醫(yī)院急診科;3西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:panlonf@qq.com;#共同通訊作者,E-mail:lilijun3162003@aliyun.com)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是在冠狀動脈病變的基礎(chǔ)上,冠脈血供急劇減少或中斷,從而使相應(yīng)的心肌嚴(yán)重而持久地缺血缺氧所導(dǎo)致的心肌壞死。盡管近年來醫(yī)療水平不斷提升,冠脈血管成形術(shù)、冠脈旁路搭橋及溶栓治療的應(yīng)用不斷深入,住院病人的死亡率得以穩(wěn)定下降,但急性心肌梗死后心衰的患者是增加的[1],考慮其與心梗血管再通治療后仍存在微循環(huán)栓塞有關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)超聲有輔助溶栓改善微循環(huán)的作用[3],但對于超聲改善微循環(huán)的機(jī)制說法不一。本研究探討超聲聯(lián)合微泡改善大鼠心肌梗死后梗死區(qū)微循環(huán)的方法及其機(jī)制,從而增加存活心肌數(shù)量,改善心梗預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性10周齡SD大鼠(SCXK(陜)2012-003)90只,清潔級,體質(zhì)量(300±30)g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供。于西安交通大學(xué)藥物分析研究所清潔動物房飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件:6只大鼠/籠,室溫23 ℃,相對濕度(50±10)%,飼予普通大鼠顆粒飼料,飲清水。

1.2 主要試劑與儀器

微泡為意大利Bracco公司產(chǎn)品,即注射用六氟化硫微泡(聲諾維)為目前我國唯一批準(zhǔn)臨床使用的超聲造影劑。聲諾維為無菌凍干粉狀,打開包裝后,注入10 ml生理鹽水并振搖,使生理鹽水與瓶中粉末及氣體混合均勻形成微泡混懸液,微泡的濃度為(2-5)×107個/ml,微泡平均直徑為2.5 μm左右,能很好地通過肺循環(huán)。超聲診斷儀(Sonosite180 Plus,美國,C60/5-2 MHz 60 mm凸陣探頭,頻率3.5 MHz,機(jī)械指數(shù)1.3),由西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科提供。

1.3 心肌梗死模型的制備

乙醚麻醉大鼠,仰臥位固定,胸部剃毛,75%酒精消毒,于胸骨左側(cè)緣第4肋間縱行切開皮膚,止血鉗鈍性分離肌肉,用彎血管鉗于胸骨左側(cè)第4肋間稍用力打開胸腔,沿肋間隙方向迅速鈍性分離肋間肌肉,血管鉗垂直方向撐開肋間隙,暴露心臟,從胸腔內(nèi)把心臟擠出,剪開心包膜,在肺動脈圓錐和左心耳之間下方約3 mm處,用4-0帶針縫合線結(jié)扎冠狀動脈左前降支,進(jìn)針深度約1.5 mm,心肌梗死成功的標(biāo)志為左心室前壁肌肉顏色變白,左室前壁心肌運(yùn)動明顯變?nèi)酢＝Y(jié)扎后迅速將心臟送回胸腔并擠出胸腔內(nèi)氣體,用直止血鉗夾閉胸壁切口。將大鼠側(cè)臥位,若大鼠未恢復(fù)自主呼吸,則用左手拇指、食指及中指給大鼠做胸外按壓約200次/min,至大鼠恢復(fù)自主呼吸為止。縫合切口,將大鼠側(cè)臥于溫暖的鼠籠內(nèi)。整個開胸時間小于30 s。術(shù)后常規(guī)采食、飲水,腹腔注射青霉素鈉80萬U/d,連續(xù)3 d。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物分組與處理

成功制備90只心肌梗死模型大鼠,隨機(jī)分為超聲微泡組、超聲組、單純心梗組,每組30只。超聲微泡組大鼠于心梗后24 h和48 h,10%水合氯醛0.03 ml/kg腹腔注射麻醉,固定于手術(shù)臺,用注射器抽取配好的微泡造影劑1 ml,經(jīng)舌下靜脈緩慢輸注微泡10 min,同時診斷超聲儀每隔5 s經(jīng)胸壁輻照心肌共10 min。超聲組大鼠1 ml生理鹽水經(jīng)舌下靜脈滴注10 min,同時診斷超聲儀每隔5 s經(jīng)胸壁輻照心肌共10 min。單純心梗組大鼠不做任何處理。所有大鼠分別于心梗模型前1 d、心梗模型制作成功后1,2,3 d記錄大鼠心電圖。超聲微泡組和超聲組大鼠于心梗后第1, 2天記錄大鼠超聲聯(lián)合微泡治療前和治療后的心電圖。

1.5 心臟標(biāo)本的采集與固定

大鼠心肌梗死后第3天,每組取10只斷頸處死,于心底部將心臟與大血管和組織剪斷,取出心臟,用生理鹽水將心臟沖洗干凈,去除左右心房,用刀片沿著與左心室長軸垂直的切面將心臟中1/3切成3-4 mm厚的組織片,取標(biāo)本的心肌梗死區(qū),30 mg/L戊二醛4 ℃,固定2 h;PBS緩沖液漂洗3次,每次5 min;乙醇逐級脫水;真空干燥,將干燥后的標(biāo)本沿左室長軸的垂直方向從中間掰開,將掰開的標(biāo)本橫斷面向上黏貼在標(biāo)本托盤上;真空噴金后掃描電鏡觀察心肌的微觀結(jié)構(gòu)。余大鼠(每組20只)于心梗后第28天斷頸處死,于心底部將心臟與大血管和組織剪斷,取出心臟,用生理鹽水將心臟沖洗干凈,去除左右心房。心肌標(biāo)本用4%多聚甲醛固定24-48 h,石蠟包埋。將石蠟包埋的心肌組織制成5 μm厚度的切片,將載玻片用多聚賴氨酸處理后將切片黏附于該載玻片上,分別進(jìn)行HE染色處理。光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織的形態(tài)、壞死、炎性細(xì)胞浸潤和梗死區(qū)瘢痕組織及血管新生等情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,統(tǒng)計分析采用SPSS17.0及Microsoft Excel軟件進(jìn)行分析,組間的兩兩比較采用t檢驗(yàn),心電圖的組間比較采用卡方檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心電圖結(jié)果

大鼠的心肌梗死模型制作前1 d、梗死后第1,2,3天分別記錄Ⅱ?qū)碾妶D。心肌梗死前大鼠的心電圖正常;心肌梗死后第1天大鼠心電圖ST段明顯抬高;心肌梗死后第2天大鼠心電圖ST段仍有抬高;心肌梗死后第3天大鼠心電圖,可見壞死性Q波,ST段仍有抬高(見圖1)。超聲微泡組30只大鼠中有9只大鼠心電圖于超聲聯(lián)合微泡治療后出現(xiàn)室性心律失常(見圖2),表現(xiàn)為QRS波寬大畸形(QRS間期平均值為40 ms,正常QRS波間期平均值為20 ms),T波倒置(平均深度為0.1 mV),次日恢復(fù);超聲組30只大鼠中有1只的心電圖出現(xiàn)上述變化,單純心梗組30只大鼠的心電圖無上述變化?？ǚ綑z驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示:超聲微泡組出現(xiàn)室性心律失常的大鼠數(shù)量與超聲組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.68,P=0.005 6);超聲微泡組出現(xiàn)室性心律失常的大鼠數(shù)量與單純心梗組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.37,P=0.003 8);而超聲組出現(xiàn)室性心律失常的大鼠數(shù)量與單純心梗組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0,P=1)。結(jié)果提示心律失常的發(fā)生與超聲聯(lián)合微泡改善微循環(huán)相關(guān)。

圖1 單純梗死組大鼠心電圖Figure 1 Electrocardiogram in rats with simple infarction

2.2 掃描電鏡觀察心肌微結(jié)構(gòu)結(jié)果

心梗后第3天,超聲聯(lián)合微泡組心梗大鼠心肌微結(jié)構(gòu)好于其他組,可識別心肌纖維束狀結(jié)構(gòu),但肌束間的間隙較正常心肌小且模糊(圖3A)。單純心梗組與超聲組大鼠的心肌細(xì)胞纖維結(jié)構(gòu)消失,原有的肌束結(jié)構(gòu)紊亂并消失融合,呈現(xiàn)為雜亂無章、大小不一、松散狀(圖3B,C),但在心肌橫斷面仍可見血管斷面及血管內(nèi)的紅細(xì)胞(圖3B)。

圖2 超聲微泡組大鼠心電圖Figure 2 Electrocardiogram of rats in ultrasound combined with microbubbles group

A.超聲微泡組B.超聲組C.單純心梗組圖3 掃描電鏡圖觀察心肌微結(jié)構(gòu) (×500)Figure 3 Ultrastructure of myocardium under scanning electron microscope (×500)

2.3 HE染色計數(shù)心肌血管環(huán)數(shù)結(jié)果

大鼠心肌梗死后第28天HE染色結(jié)果及數(shù)據(jù)分析見圖4,5。從圖4可見超聲微泡組血管環(huán)數(shù)量最多,存活的心肌也最多,提示增加血液的灌注可使心肌的存活量增加,單純超聲不能促血管環(huán)數(shù)增加,而超聲聯(lián)合微泡可增加血管環(huán)數(shù)量。梗死區(qū)可見較多血管環(huán),在200倍顯微鏡下計數(shù)血管環(huán)數(shù),超聲微泡組最多,與超聲組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.53,P=0);與單純心梗組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.93,P=0)。單純心梗組血管數(shù)最少,但與超聲組相比,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.01,P=0.05)。

A.超聲微泡組B.超聲組C.單純心梗組圖4 梗死后28 d HE染色毛細(xì)血管環(huán)計數(shù) (×200)Figure 4 HE staining of capillary ring count at 28 d after myocardial infarction (×200)

與超聲組比較,*P<0.05;與單純心梗組比較,#P<0.05圖5 梗死后第28天毛細(xì)血管環(huán)計數(shù)Figure 5 Capillary ring count 28 d after infarction in three groups

3 討論

研究表明,在急性心肌梗死后及時接受急診溶栓或介入治療的急性心肌梗死患者中,仍有65%患者的冠狀動脈微循環(huán)存在持續(xù)性栓塞[2],部分患者因錯過搶救時機(jī)冠脈閉塞難以溶解,使缺血心肌血供難以恢復(fù),心肌大量壞死,隨后被纖維組織取代,形成瘢痕組織,進(jìn)而心室重構(gòu),成為心衰和死亡的主要原因。本研究顯示,超聲聯(lián)合微泡可改善早期心肌梗死大鼠梗死區(qū)心肌的灌注,增加梗死區(qū)血管環(huán)數(shù),改善梗死區(qū)心肌的微循環(huán)利于更多心肌細(xì)胞存活,從而減輕心肌纖維化、心室重構(gòu),使心功能得到改善。

冠脈內(nèi)微血栓的形成是由斑塊破裂引發(fā)凝血瀑布級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致的[4]。Li等[3]研究發(fā)現(xiàn)超聲聯(lián)合微泡治療可以溶解富含血小板和紅細(xì)胞的微血栓,從而改善冠狀動脈無復(fù)流的結(jié)果。在體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[5],超聲輻照超聲能量敏感型相變納米微泡,可產(chǎn)生持續(xù)穩(wěn)定的空化效應(yīng),有效清除人工血管的血栓,從而達(dá)到改善心肌梗死區(qū)微循環(huán)的作用。在體外微血管阻塞的模型中超聲微泡的空化效應(yīng)與組織纖溶酶激活劑聯(lián)合應(yīng)用可提高再灌注效果[6]。另外,在豬的心肌梗死模型中應(yīng)用三維超聲聯(lián)合微泡可再通冠脈血管[7]。在急性心肌梗死早期溶栓或介入治療過程中,再灌注性心律失常是冠脈血管再通的一個間接指征。本研究顯示超聲聯(lián)合微泡組的大鼠心電圖于超聲聯(lián)合微泡治療后出現(xiàn)室性心律失常,次日恢復(fù);超聲組的大鼠只有1只心電圖出現(xiàn)上述變化,無超聲治療的大鼠心電圖無上述變化。提示心律失常的發(fā)生與超聲聯(lián)合微泡改善微循環(huán)相關(guān)。單純診斷超聲的能量對心肌沒有影響,而只有在微泡存在的情況下,產(chǎn)生超聲的物理效應(yīng)可改善心肌的微循環(huán)。

研究表明,大鼠心肌梗死后骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在缺血的微環(huán)境下是不能向心肌細(xì)胞分化的且不能長期存活[8],因此改善心肌梗死后缺血心肌的微循環(huán)灌注至關(guān)重要。大量的研究表明,超聲輻照微泡引發(fā)的生物學(xué)效應(yīng),可使微血管破裂,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),使血管生長因子的表達(dá)水平增加,從而促進(jìn)血管新生[9]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),促進(jìn)梗死區(qū)域新生血管網(wǎng)形成,增加血流灌注[10],對改善心肌梗死的預(yù)后、提高心功能有非常重要的作用。Yoshida等[11]研究發(fā)現(xiàn),超聲介導(dǎo)微泡的破裂產(chǎn)生的微損傷和微出血,使炎癥細(xì)胞浸潤并釋放VEGF,而VEGF促血管新生。在超聲介導(dǎo)微泡破裂增強(qiáng)MSCs移植效應(yīng)的研究中[12],也發(fā)現(xiàn)超聲聯(lián)合微泡使心肌內(nèi)VEGF水平增加,新生的血管增加。本實(shí)驗(yàn)研究顯示梗死區(qū)域血管數(shù)量越多,存活的心肌也越多,且超聲聯(lián)合微泡組血管環(huán)數(shù)量最多。這種血管再生可貢獻(xiàn)于微循環(huán)的改善并有利于心肌再生,減緩心肌纖維化和瘢痕組織生成。

本研究所用的微泡聲諾維(SonoVue)為第二代超聲造影劑,其已廣泛應(yīng)用于臨床超聲造影檢查,安全性已得到很好證實(shí)。實(shí)驗(yàn)中通過超聲輻照聲諾維微泡產(chǎn)生的空化效應(yīng)等物理效應(yīng),可改善心梗模型大鼠梗死區(qū)心肌的微循環(huán),改善預(yù)后。本研究的心梗模型的大鼠未行冠脈血管開通治療,如在心梗后實(shí)行開通血管治療的基礎(chǔ)上再聯(lián)合超聲微泡治療是否可以更好地改善心肌微循環(huán),以及后續(xù)臨床應(yīng)用效果,均有待后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證。

總之,超聲聯(lián)合微泡可改善心肌梗死模型大鼠的梗死區(qū)微循環(huán),增加血管環(huán)數(shù)及存活心肌,為急性心肌梗死的臨床治療和提高病患生存質(zhì)量提供了一種值得嘗試的方法。