昭通牛Y-SNPs和Y-STRs遺傳多樣性和父系起源研究

寧慶慶， 亐開(kāi)興， 胡應(yīng)武， 張繼才， 黃必志， 陳 宏， 雷初朝*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.云南省草地動(dòng)物科學(xué)研究院，云南 小哨 650212；3.云南省新平縣者竜鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南 新平 653408)

昭通牛主產(chǎn)于云南省昭通市，分布于全市所轄11個(gè)縣(區(qū))，屬云南省地方優(yōu)良品種[1-2]。產(chǎn)區(qū)分布區(qū)域從海拔267 m江邊河谷區(qū)到海拔3 090 m高寒山區(qū)，屬亞熱帶氣候類(lèi)型。1962年在昭通盆地(在距今約100萬(wàn)年前的更新紀(jì)地層中)發(fā)現(xiàn)原牛化石，表明昭通牛馴化歷史久遠(yuǎn)，并經(jīng)過(guò)當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境和人為的長(zhǎng)期選育，形成現(xiàn)在的昭通牛[1]。昭通牛屬于役肉兼用型，其特點(diǎn)是性格溫順，行動(dòng)敏捷，管理性能好；體質(zhì)堅(jiān)實(shí)勻稱，肉質(zhì)良好，難產(chǎn)率低；耐粗、耐寒、耐旱、耐熱、耐濕、適應(yīng)性強(qiáng)，役用性能好[1]。目前，昭通牛商業(yè)用途的廣泛化使其引入很多外來(lái)牛品種凍精進(jìn)行雜交改良，導(dǎo)致純種昭通牛數(shù)量急劇減少，如果不加以保護(hù)，昭通?？赡茉诓痪玫膶?lái)處于瀕危狀態(tài)。

Y染色體由雄性特異區(qū)(MSY)和擬常染色體區(qū)(PAR)組成，其中MSY區(qū)作為Y染色體的非重組區(qū)，具有父系遺傳的特點(diǎn)，且Y染色體單倍體性完整，有較低的突變率并不易受重組和回復(fù)突變等因素的影響，故為家牛的起源進(jìn)化、遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)等研究的重要工具[3]。近年來(lái)，Y染色體單核苷酸多態(tài)性(Y-SNPs)和微衛(wèi)星(Y-STRs)標(biāo)記已作為家牛遺傳研究的重要依據(jù)。相關(guān)研究[4-7]證實(shí)，家牛有3種Y染色體單倍型組，分別為普通牛Y1和Y2單倍型組以及瘤牛Y3單倍型組。Gotherstrom等[3]對(duì)歐洲牛的MSY區(qū)多個(gè)SNPs標(biāo)記發(fā)現(xiàn)2個(gè)位點(diǎn)(UTY-19和ZFY-5)可分離Y1和Y2單倍型組，推測(cè)Y1單倍型組起源于歐洲野牛；Ginja等[4]利用Y-SNPs(DDX3Y、UTY-19和ZFY)、1個(gè)Indel(ZFY-10)和Y-STRs(IRNA124、IRNA189、BM861、UMN0103、UMN0307和UMA0504)標(biāo)記對(duì)葡萄牙本土13個(gè)牛品種、外來(lái)牛3個(gè)品種及婆羅門(mén)牛品種的遺傳多態(tài)性和父系起源進(jìn)行調(diào)查，揭示了葡萄牙本地牛品種的單倍型及品種間的遺傳關(guān)系；Edwards等[5]利用Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)和Y-STRs(IRNA189和BM861)標(biāo)記對(duì)歐洲和亞洲共138個(gè)牛品種進(jìn)行分析，結(jié)果表明：歐洲牛只攜帶普通牛單倍型組(其中Y1單倍型組主要分布于歐亞大陸北部，Y2單倍型組主要分布在中歐地區(qū))；而瘤牛Y3單倍型組主要在西南亞地區(qū)占明顯優(yōu)勢(shì)。

我國(guó)作為牛品種極為豐富的國(guó)家，擁有53個(gè)地方黃牛品種[2]，根據(jù)外形特征、地域分布和氣候特點(diǎn)又可將黃牛分為北方黃牛、南方黃牛和中原黃牛。迄今為止，周艷等[8]利用線粒體DNA多態(tài)性對(duì)昭通牛群體遺傳多樣性及變異特征進(jìn)行了研究，但有關(guān)昭通牛Y染色體的父系起源、遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)等方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究利用2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記(UTY-19和ZFY-10)和2個(gè)Y-STRs標(biāo)記(IRNA189和BM861)聯(lián)合分析的方法，對(duì)昭通牛的父系起源、遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行探究，以期為今后開(kāi)展昭通牛的分子育種和資源保種工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣及基因組DNA提取

在云南省昭通市威信縣三桃鄉(xiāng)昭通牛分布區(qū)，采集公牛耳組織樣，于75%酒精中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室。采取常規(guī)酚—氯仿抽提法對(duì)基因組DNA進(jìn)行提取，稀釋至10～20 ng/μL保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成和PCR擴(kuò)增

參照已發(fā)表的家牛Y染色體2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記(UTY-19和ZFY-10)和Y-STRs標(biāo)記(IRNA189和BM861)的引物信息[3-5]合成4對(duì)引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(12.5 μL)：2×Es TaqMasterMix(Dye) 6.00 μL，Sterile ddH2O 5.00 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.25 μL，模板DNA 1.00 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，Tm(表1)退火30 s，72 ℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)；72 ℃充分延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含Goldview核酸染料)電泳后，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，將檢測(cè)合格的產(chǎn)物送至上海生物工程有限技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.3 產(chǎn)物測(cè)序和單倍型分析

將PCR純化產(chǎn)物送至生工生物工程股份有限公司(上海)用3730XL型DNA測(cè)序儀進(jìn)行正、反向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)Chromas 2.6.5軟件進(jìn)行查看和校正，得到每頭昭通公牛的2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記(UTY-19和ZFY-10)測(cè)序序列。2個(gè)Y-STRs標(biāo)記的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行熒光分型，獲得INRA189和BM861等位基因大小。結(jié)合Y-SNPs和Y-STRs標(biāo)記的數(shù)據(jù)，獲得昭通牛公牛的單倍型(Y-SNPs-INRA189-BM861)，再用Arlequin 3.11軟件進(jìn)行單倍型多樣度計(jì)算。

表1 家牛2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記和2個(gè)Y-STRs標(biāo)記的相關(guān)信息

2 結(jié)果與分析

通過(guò)對(duì)24頭昭通牛2個(gè)Y-SNPs多態(tài)性標(biāo)記測(cè)定序列比對(duì)分析，結(jié)果表明：UTY-19標(biāo)記僅有一種C>A顛換突變，頻率為100%；ZFY-10標(biāo)記存在C>T轉(zhuǎn)換突變，頻率為70.83%。根據(jù)Gotherstrom和Ginja[3-4]等對(duì)Y染色體單倍型的判定標(biāo)準(zhǔn)，昭通牛公牛存在Y2和Y3兩種單倍型組(表2)。其中7頭昭通牛屬于普通牛Y2單倍型組，所占頻率為29.17%；19頭昭通牛屬于瘤牛血統(tǒng)Y3單倍型組，所占頻率為70.83%。表明昭通牛的父系起源以瘤牛為主，且其地域分布屬于南方黃牛類(lèi)型，與中國(guó)南方黃牛的起源進(jìn)化相一致。

表2 昭通牛Y染色體單倍型與單倍型頻率

利用2個(gè)Y-STRs標(biāo)記熒光分型，結(jié)果表明：昭通牛在INRA189標(biāo)記中只有2個(gè)等位基因，大小分別為88 bp和90 bp；昭通牛在BM861標(biāo)記中存在156 bp和158 bp 2個(gè)等位基因(表2)。結(jié)合2個(gè)Y-SNPs和2個(gè)Y-STRs標(biāo)記聯(lián)合分析，確定昭通牛群體存在兩種單倍型：Y2-90-158和Y3-88-156(表2)，頻率分別為29.17%(7/24)和70.83%(17/24)，表明昭通牛有普通牛和瘤牛2個(gè)父系起源。昭通牛群體的Y染色體單倍型多樣度為0.4312±0.0812，表明其遺傳多樣性較高。

3 討 論

近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)Y-SNPs和Y-STRs標(biāo)記多態(tài)性的研究極大地推動(dòng)了家牛父系遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)程。常振華等[9]利用4個(gè)Y-SNPs(DDX3Y-7、UTY-19、ZFY-9和ZFY-10)標(biāo)記分析了中國(guó)黃牛16個(gè)品種以及4頭緬甸牛的Y染色體遺傳多樣性，結(jié)果顯示中國(guó)黃牛存在Y2和Y3兩種單倍型組，且自北到南Y2單倍型組頻率逐漸降低，而Y3單倍型組頻率逐漸增加；緬甸牛均為Y3單倍型組。Cai等[6]通過(guò)2個(gè)Y-STRs(UMN2404和UMN0103)分子標(biāo)記對(duì)25個(gè)中國(guó)黃牛品種進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)南方地區(qū)的瘤牛等位基因頻率占92.4%，而北方地區(qū)的普通牛等位基因頻率占95.5%；并推測(cè)海南島可能是瘤牛的起源地，而西藏?？赡苁橇硪粋€(gè)支系馴化而來(lái)。Li等[7]利用4個(gè)Y-SNPs和2個(gè)Y-STRs對(duì)中國(guó)16個(gè)黃牛品種的Y染色體多態(tài)性進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)各種單倍型組的頻率得出的結(jié)果與Cai等[6]研究結(jié)果基本一致。諸多研究結(jié)果證實(shí)，中國(guó)黃牛的單倍型組分布具有明顯的地理結(jié)構(gòu)特征，這與mtDNA相關(guān)研究[10-11]、歷史及地理信息結(jié)果一致。

Xia等[12]分析了我國(guó)34個(gè)中國(guó)黃牛品種Y-SNPs(UTY19和ZFY10)和Y-STRs(INRA189和BM861)的多態(tài)性，結(jié)果表明：中國(guó)黃牛存在14種單倍型，其中Y2-104-158和Y2-102-158是中國(guó)北部和中部最常見(jiàn)的普通牛單倍型，而瘤牛單倍型Y3-88-156在中國(guó)南方占優(yōu)勢(shì)；單倍型Y2-108-158、Y2-110-158、Y2-112-158和Y3-92-156是中國(guó)牛所特有的。本研究同樣采用Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)和Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)結(jié)合的方法[4-7]，確定昭通牛有Y2-90-158和Y3-88-156兩種單倍型，其中Y3-88-156單倍型占主導(dǎo)地位(70.83%)，說(shuō)明昭通牛主要是瘤牛父系起源，這與昭通牛在中國(guó)的地理分布相一致?；趍tDNA D-loop區(qū)多態(tài)性分析，周艷等[8]首先報(bào)道了昭通牛是以普通牛為主的母系起源。隨后，Xia等[11]對(duì)中國(guó)黃牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳多態(tài)性進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)昭通牛主要存在普通牛單倍型組T3(52.4%)和瘤牛單倍組I1(33.3%)兩種母系起源，結(jié)合本研究結(jié)論證實(shí)昭通牛為普通牛與瘤牛起源，與其品種的形成歷史相一致[1-2]。本研究中，24頭昭通牛的單倍型多樣度為0.4312±0.0812，稍高于Edwards等[5]報(bào)道的138個(gè)國(guó)外牛品種的平均單倍型多樣度0.422±0.3，低于Li等人[7]揭示的中國(guó)16個(gè)黃牛品種的單倍型多樣度0.6831±0.0134，說(shuō)明昭通牛群體遺傳多樣性相對(duì)較高。目前，昭通牛品種逐漸受到國(guó)外引入肉牛品種西門(mén)塔爾牛和我國(guó)自主培育的肉牛品種云嶺牛的雜交，雜交公牛多實(shí)行育肥出售，導(dǎo)致昭通牛原有的遺傳資源正在逐漸減少。因此，建議建立昭通牛保種區(qū)或保種場(chǎng)，加強(qiáng)純種選育、提高和保護(hù)，避免其遺傳資源的流失，為我國(guó)肉牛新品種培育提供育種素材。