高脂誘導下胰島素抵抗和非胰島素抵抗小鼠糖脂代謝及腸道AKK菌的變化

田滋潤， 王 燁, 韓 雪， 王蟾月， 王曉曉， 楊 浩， 朱曼麗， 李琳琳

(新疆醫(yī)科大學藥學院， 烏魯木齊 830011)

胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的主要環(huán)節(jié)[1]，是指由于營養(yǎng)過剩、脂質(zhì)分布異常、感染、膿毒癥致炎癥等原因引起的胰島素敏感組織如骨骼肌、肝臟、脂肪組織等對胰島素的敏感性下降，并引起下游細胞信號通路缺陷和機體自穩(wěn)平衡失調(diào)的現(xiàn)象[2]。目前有研究顯示，腸道菌群結構的改變是引起肥胖和胰島素抵抗等代謝性疾病的主要原因之一[3-5]。本研究通過高脂誘導胰島素抵抗小鼠實驗，對比研究胰島素抵抗成模小鼠和未成模小鼠糞便中糖脂代謝及AKK菌的變化，確定腸道菌群在胰島素抵抗形成過程中的重要性。

1 材料

1.1 儀器與試劑實時熒光定量儀(Bio-rad IQ5 美國)，凝膠成像儀(Bio-rad IQ5 美國)，微量分光光度計(ND-2000，美國)，全自動酶標儀(Multiskan GO,Thermo公司)。膽固醇測定試劑盒、甘油三酯測定試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司；糞便基因DNA提取試劑盒(凱杰，德國)；實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司，日本)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，2×Tag PCR MasterMix、DNA Marker、6×Loading buffer(天根生化科技有限公司)；所用引物由新疆歐易生物公司合成。

1.2 實驗動物SPF級正常C57BL/6J小鼠，雄性，鼠齡6～8周，體質(zhì)量為18～22 g，35只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006，實驗動物質(zhì)量合格證:11400700307064。實驗動物飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物飼料生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2014-0008，實驗動物飼料質(zhì)量合格證：11003800016856。動物飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學SPF級實驗動物中心，溫度(23±2) ℃，濕度40%～45%，每天光照12 h，單籠單只飼養(yǎng)，自主飲水。

1.3 分組35只C57BL/6J小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常飲食對照組(normal control diet，NCD組)10只，高脂飲食組(high fat diet，HFD組)25只，飲食干預8周后，檢測各組小鼠血糖、血脂、口服葡萄糖耐量及胰島素敏感性的變化，根據(jù)HFD組檢測指標結果，從中篩選出胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和非胰島素抵抗(non-insulin resistance，N-IR)小鼠各10 只，分別為IR組和N-IR組。小鼠胰島素抵抗成模標準：小鼠胰島素耐量試驗時小鼠40 min血糖下降百分數(shù)<40% 納入為胰島素抵抗。

1.4 實驗方法

1.4.1 口服葡萄糖耐量試驗 動物禁食8 h(自由飲水)后，尾尖采血，用移液槍吸取10 μL血樣加入到加有90 μL抗凝劑的1.5 mL EP管中，測定(0 min)。然后灌胃給予葡萄糖(2 g/kg體質(zhì)量)，分別于糖負荷后30、60、120 min尾尖采血，用移液槍吸取10 μL血樣加入到加有90 μL抗凝劑的1.5 mL的EP管中，用葡萄糖氧化酶法測定血糖，并計算血糖曲線下面積(AUC)。

1.4.2 胰島素耐量實驗 動物禁食8 h(自由飲水)后，尾尖采血，用移液槍吸取10 μL血樣加入到有90 μL抗凝劑的1.5 mL EP管中，測定FBG(0 min)。隨后根據(jù)小鼠體質(zhì)量(0.5 U/kg體質(zhì)量)皮下注射精蛋白鋅重組人胰島素注射液(優(yōu)泌林)；分別于胰島素注射后40、90、120 min尾尖采血，用移液槍吸取10 μL血樣加入到有90 μL抗凝劑的1.5 mL EP管中，用葡萄糖氧化酶法測定血糖，并計算血糖AUC及AUC下降百分數(shù)。

1.4.3 生化指標的測定 動物禁食8 h(自由飲水)后，尾尖采血，用移液槍吸取10 μL血樣加入到加有90 μL抗凝劑的1.5 mL EP管中，用相應試劑盒測定空腹血漿總膽固醇(TG)及甘油三酯(TC)。

1.4.4 糞便樣本的采集及腸道微生物總DNA的提取 分別于高脂干預前和干預第8周，用小鼠代謝籠收集小鼠的新鮮糞樣于凍存管中，-80℃保存。用糞便基因DNA提取試劑盒提取小鼠腸道微生物總DNA，用微量分光光度計測定DNA濃度與純度。

1.4.5 實時熒光定量PCR檢測目標菌群水平

1.4.5.1 標準曲線的制作 擴增AKK菌所用引物參照文獻[6]， 上游引物： 5′-AGAGGTCTCAAGC-GTTGTTCGGAA-3′下游引物：5′-TTTCGCTCCCCTGGCCTTCGTGC-3′，擴增片段大小285 bp。以PCR擴增AKK菌16SrDNA條帶為靶片段，經(jīng)切膠回收后作為目標菌DNA標準品，操作過程嚴格按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明進行。

1.4.5.2 小鼠糞樣中目標菌群水平的檢測 將標準品稀釋到濃度梯度為10-1～10-8copies/μL的DNA樣本為陽性模板，并將最后一個濃度梯度設置為起始拷貝數(shù)(LogSQ)=1,同時以去核酸水為陰性對照，每個樣品都設置復孔，進行熒光定量PCR，擴增體系：目標菌上下游引物各1 μL，熒光染料SYBR Green Ⅱ 12.5 μL，樣品(糞菌總DNA) 2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應條件：預變性 95℃、3 min，變性 95℃、15 s，退火 65℃、30 s，共40個循環(huán)。

2 結果

2.1 高脂誘導對C57BL/6J小鼠體質(zhì)量的影響高脂誘導8周，與NCD組小鼠相比，IR組小鼠體質(zhì)量從實驗第1周就明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而N-IR組小鼠體質(zhì)量從實驗第6周才明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與IR組小鼠相比，N-IR組小鼠體質(zhì)量從實驗第1周，明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果見圖1a。

2.2 高脂誘導對C57BL/6J小鼠FBG及血脂水平的影響高脂飲食干預8周，與NCD組相比，IR組小鼠FBG和TC水平，明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，TG水平有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；N-IR組小鼠TC水平，明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，F(xiàn)BG和TC水平有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與IR組相比，N-IR組小鼠FBG水平，明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，TC和TG水平有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。

表1 高脂飲食干預對C57BL/6J小鼠空腹血糖及血脂水平的影響

注：與NCD組比較,*P<0.05；與IR組比較,#P<0.05。

2.3 高脂誘導對C57BL/6J小鼠糖耐量異常的影響高脂誘導8周，與NCD組相比，IR組和N-IR組小鼠OGTT曲線下面積，均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但N-IR組小鼠OGTT曲線下面積增加明顯小于IR(P<0.05)，表明N-IR小鼠口服葡萄糖耐量異常程度小于IR組小鼠。結果見表2、圖1b。

2.4 高脂誘導對C57BL/6J小鼠胰島素敏感性的影響高脂飲食干預8周，與NCD組相比，IR組和N-IR組小鼠ITT曲線下面積，均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明IR組和N-IR組小鼠胰島素敏感性異常；與IR組相比，N-IR組小鼠ITT曲線下面積，明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明N-IR小鼠胰島素敏感性異常程度低于IR組小鼠，未達到胰島素抵；IR組和N-IR組小鼠40 min血糖下降百分數(shù)分別為20.36%和42.52%。結果見表2、圖1c。

2.5 高脂誘導對C57BL/6J小鼠腸道AKK菌豐度的影響高脂飲食干預8周，與NCD組相比，IR組小鼠腸道AKK菌豐度明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，N-IR組小鼠腸道AKK菌豐度有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與IR組相比，N-IR組小鼠腸道AKK菌豐度有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗結果表明AKK菌豐度變化與小鼠的胰島素抵抗存在相關性，結果見圖1d。

注：與NCD組相比， aP<0.05； 與IR組相比， cP<0.05。圖1 高脂誘導對各組小鼠體質(zhì)量(a)、口服葡萄糖耐量(b)、胰島素耐量(c)、AKK菌豐度水平(d)的影響表2 高脂飲食干預對C57BL/6J小鼠口服葡萄糖和胰島素耐量實驗曲線下面積的影響

組別口服葡萄糖耐量實驗曲線下面積0周8周胰島素耐量實驗曲線下面積0周8周NCD組1 074.18±89.081 128.75±76.33607.15±83.66628.31±70.50IR組1 058.35±102.521 550.60±167.40*607.44±111.68917.11±98.76*N-IR組1 101.46±54.821 424.03±82.01*#580.78±74.24766.62±45.91*#

注：與NCD組比較,*P<0.05； 與IR組比較,#P<0.05。

3 討論

通過用高脂飼料喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠來誘導其產(chǎn)生胰島素抵抗，是本課題組研究腸道菌群與2型糖尿病關系的常用動物模型。在前期造模過程中，我們發(fā)現(xiàn)，在同樣的飼養(yǎng)環(huán)境下，高脂飲食干預8周時，80 % 的動物均達到胰島素抵抗模型，而有約20%的動物仍處于非胰島素抵抗狀態(tài)，此種現(xiàn)象引起了我們的注意，因此本研究對實驗動物高脂飼養(yǎng)8周后，檢測小鼠糖脂代謝指標水平，以胰島素耐量試驗40 min血糖下降百分數(shù)<40% 為標準，篩選出胰島素抵抗組和非胰島素抵抗組小鼠，收集它們0周和8周糞樣，運用基于16SrRNA的實時熒光定量PCR技術分析各組小鼠糞便中腸道菌群的變化，旨在找到與胰島素抵抗發(fā)生可能相關的靶標菌，為腸道菌群與2型糖尿病的研究提供基礎依據(jù)。

近年來，腸道菌群與人類疾病的研究領域逐漸成為熱點，尤其在腸道菌群與2型糖尿病等代謝性疾病的關系研究。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，多形擬桿菌、氣單胞菌等均與2型糖尿病的發(fā)生存在一定的相關性[7-8]，但機制不明。目前，腸道菌群失調(diào)與2型糖尿病發(fā)生的可能機制研究主要有短鏈脂肪酸學說、膽汁酸學說、內(nèi)毒素學說、生長因子學說等[9]。

隨著分子生物學技術的發(fā)展，越來越多與胰島素抵抗和肥胖等代謝紊亂相關聯(lián)的關鍵益生菌株被發(fā)現(xiàn)(如Akk菌)。Akk菌是一種革蘭氏陰性厭氧球菌，2004年，德里安教授和她的團隊將其在人體腸道中分離出來，命名為Akkermansia muciniphila。Akk菌可以使用人類腸道上皮細胞覆蓋著的一層黏膜層，作為其能源，因該黏膜層富含黏蛋白。這種黏液層可以作為許多腸道菌群的黏合劑，促進人體和微生物相互作用。Akk菌通過使用這種黏蛋白，與腸道內(nèi)其他菌群產(chǎn)生競爭作用從而保護腸道免受病原體侵害[10]。與其他腸道菌不同的是，Akk菌可以儲備黏蛋白，即使在腸道中沒有營養(yǎng)物質(zhì)(特別是在禁食期間)，也可以蓬勃地繁衍生息。除了利用黏蛋白作為能源供給，科學家們認為Akk菌也可能參與恢復腸道黏蛋白儲備的機制，達到自給自足[11]。Akk菌被認為是健康人體腸道中最豐富的黏液溶解細菌。腸道中低水平的Akk菌可能導致黏膜層的變薄，從而導致腸道屏障功能減弱，使腸道內(nèi)的毒素更容易侵入人體?；加醒装Y性腸病、肥胖癥和II型糖尿病的患者體內(nèi)的Akk菌含量會有所降低[12]。Akk菌在降解黏蛋白的同時，會釋放各種副產(chǎn)物，包含乙酸，這是腸道中一種重要的短鏈脂肪酸，可以通過其厭食效應起到控制體質(zhì)量的作用。有證據(jù)表明Akk菌在腸道的數(shù)目和乙酸鹽含量之間存在很強的相關性[13]。同時，Akk菌可以誘導空腹誘導脂肪因子(FIAF)，可降低脂肪儲存能力的表達。目前的研究表明，給小鼠灌喂活的Akk菌，可以在不影響食欲和飲食習慣的情況下來預防飲食誘導性的肥胖[14]。

本研究通過對比IR組和NCD組小鼠腸道內(nèi)Akk菌豐度發(fā)現(xiàn)，IR組小鼠腸道內(nèi)Akk菌豐度顯著低于NCD組，通過對比IR組與N-IR組小鼠腸道內(nèi)Akk菌豐度發(fā)現(xiàn)，IR組小鼠腸道內(nèi)Akk菌豐度低于N-IR組。實驗結果提示，小鼠胰島素抵抗的發(fā)生可能與小鼠腸道內(nèi)Akk菌的減少相關。