花花柴脂肪酸合成相關(guān)基因KcFabZ的克隆及分析

王 磊 王彥芹

（塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

脂肪酸作為生物體基本組成成分之一，不僅是細(xì)胞膜脂的主要成分，還是重要的能源物質(zhì)。植物脂肪酸生物合成的過程復(fù)雜，需要多種酶共同協(xié)調(diào)作用來完成，植物脂肪酸合成酶FAS屬于Ⅱ脂肪酸合成酶系［1]，由β-酮脂酰-ACP合酶(FabH)、β-酮脂酰-ACP還原酶(FabG)、β-羥脂酰-ACP脫水酶(FabZ)、烯脂酰-ACP還原酶(FabI)構(gòu)成。FabZ是植物脂肪酸生物合成途徑中碳鏈延伸循環(huán)步驟的主要脫水酶［2]，能有效地催化短鏈β-羥基?；?ACP和長鏈飽和及不飽和β-羥基?；?ACP脫水，對于底物的催化活性隨著鏈的增長,催化活性降低,催化活性與鏈長成反比［3]；最早在幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）菌株SS1（HpfabZ）中克隆了fabZ基因，并通過插入擴(kuò)增的fabZ片段產(chǎn)生重組表達(dá)質(zhì)粒，純化后的HpFabZ在40℃下顯示出最高的酶活性，在90℃時，HpFabZ仍然表現(xiàn)出近50%的活性，推測HpFabZ六聚體的形成使與其熱穩(wěn)定性相關(guān)［4]；劉麗等［5]克隆了陸地棉（Gossypium hirsutum Linn）脂肪酸碳鏈延長酶β-酮脂酰-ACP還原酶（FabG）并構(gòu)建了超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化棉花，對其抗寒性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系的相對電導(dǎo)率和脯氨酸含量積累明顯高于對照，而丙二醛含量低于對照，在不同脅迫時間與對照表現(xiàn)出顯著或極顯著差異，過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系的抗寒性有所提高。溫度脅迫已是全球植物環(huán)境限制因素之一，也是造成植物細(xì)胞損傷的重要原因之一［6]。高溫脅迫會導(dǎo)致植物葉片和幼莖的焦化、葉片脫落和衰老，更嚴(yán)重的還會引起根系生長受到抑制、果實(shí)發(fā)育停止、脫落等現(xiàn)象［7]，甚至造成植株死亡［8]。在植物生長和繁殖期間，溫度的極端變化會破壞適當(dāng)生長所需的分子間相互作用，尤其對夏季開花植物，高溫還會導(dǎo)致植物散粉受阻、無法受精等，從而影響種子發(fā)育和結(jié)實(shí)［9]。

花花柴(Karelinia capsia)屬菊科(Asteraceae)、花花柴屬(Karelinia)，多年生草本植物，廣泛生長在我國新疆、甘肅、青海等地，在新疆南疆沙漠區(qū)廣泛分布?；ɑú袢~片肉質(zhì)化［10]，根系龐大，枝葉節(jié)點(diǎn)可再生，對環(huán)境有極強(qiáng)的適應(yīng)性，具有廣譜抗逆性［11]?；ɑú裼酌缭诟邷?0℃處理后，其葉片的相對電導(dǎo)率和MDA含量隨著脅迫時間延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，保護(hù)酶系統(tǒng)的活性也隨著處理時間的延長而逐漸升高［12]，但花花柴對高溫的響應(yīng)機(jī)制尚不明確?；诒緦?shí)驗(yàn)室前期對花花柴高溫處理下的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的研究，發(fā)現(xiàn)脂肪酸生物合成途徑FabZ基因差異表達(dá)。本研究通過PCR技術(shù)克隆了花花柴的FabZ基因，并分析在高溫處理下的基因表達(dá)模式，將有助于進(jìn)一步探索FabZ基因的調(diào)控作用，以及深入理解花花柴的抗逆機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料來源于塔克拉瑪干沙漠，鑒定人：塔里木大學(xué)植物學(xué)教師張玲。

選取飽滿的花花柴種子種于營養(yǎng)土：蛭石(2：1)的花盆中，在25℃、相對濕度50%，光周期為16 h光照/8 h黑暗條件下生長，待長至18～20片葉片時轉(zhuǎn)入恒溫培養(yǎng)箱中，分別在40 ℃高溫處理0 h、0.5 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h時取樣，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

植物總RNA提取試劑盒TransZol Plant購自北京全式金科技有限公司；第一鏈合成試劑盒Prime-Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)購自TAKARA公司。引物合成及常規(guī)測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成

利用TransZol Plant(全式金)試劑盒提取樣品葉片總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，利用紫外分光光度計(jì)檢測RNA的質(zhì)量和濃度，反轉(zhuǎn)錄參照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TAKARA)試劑盒，熒光定量PCR參照Bestar SybrGreen qPCR Mastermix(DBI)試劑盒。

1.2.3 花花柴FabZ基因的克隆

根據(jù)花花柴轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中功能注釋為FabZ的序列設(shè)計(jì)引物(見表1)，以0 h處理花花柴cDNA為模板，利用RT-PCR法進(jìn)行基因克隆。反應(yīng)體系采用Super Mix(恒朝)取1 μLcDNA反應(yīng)液作為模板，PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 8 min，30 cycle。膠回收參照（全式金）連接載體pMD19-T(TAKARA)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，藍(lán)白斑篩選后，挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，對PCR檢測為陽性的克隆送樣由廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4 花花柴FabZ蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析，利用MEGA6.0構(gòu)建基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析其近緣物種件的同源性，獲得相關(guān)的進(jìn)化信息；運(yùn)用clustal X多序列比對軟件進(jìn)行比對；借助在線分析軟件ProtParam(http：//web.expasy.rog/protparam/)對基因編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析；利用TMred(http：//ch.embnet.org/software/TMPRED_form/htm)和 ProtScale工具(http：//web.expasy.org)分析基因的跨膜區(qū)域及疏水結(jié)構(gòu)域；通過NCBI的CDD(Conserved domain database)數(shù)據(jù)庫對基因的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析鑒定；登錄在線軟件SOPMA對基因的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；利用在線分析軟件Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page）和SWISS-MODEL進(jìn)行基因的三級結(jié)構(gòu)分析并進(jìn)行建模；利用MEME在線分析軟件對基因的Motif進(jìn)行預(yù)測，利用Cell-PLoc 2.0進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

1.2.5 FabZ表達(dá)模式分析

利用Bestar SybrGreen qPCR Mastermix(DBI)試劑盒，根據(jù)操作指南操作配置，以處理0 h、0.5 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h 處理的花花柴cDNA為模板，PCR反應(yīng)和熒光信號檢測在（伯樂CFX96）熒光定量PCR儀上進(jìn)行，程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72℃30 s，30 cycle，每個樣設(shè)置3個平行，重復(fù)2次試驗(yàn)，以18s為內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行定量分析，引物參照（表1）。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 花花柴FabZ基因克隆及序列分析

利用設(shè)計(jì)的FabZ引物，以花花柴的全長cDNA為模板，擴(kuò)增基因長度為699 bp的序列，包括完整的CDS，編碼232個氨基酸（圖1），將基因命名為KcFabZ。在對KcFabZ的開放閱讀框理化分析中發(fā)現(xiàn)，KcFabZ的正電荷殘基數(shù)20，負(fù)電荷殘基數(shù)23，理論pI為9.00，該蛋白呈堿性，其分子量為25 474.65 D，總平均親水值為0.139，脂質(zhì)指數(shù)為89.87。

圖1 KcFabZ基因的全長序列以及翻譯出的氨基酸序列

2.2 FabZ蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

對KcFabZ蛋白做進(jìn)一步分析。根據(jù)對KcFabZ基因編碼蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)域和疏水性分析可知，Kc-FabZ基因編碼蛋白不存在跨膜區(qū)域。利用SWISS軟件對該蛋白質(zhì)進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示，KcFabZ蛋白主要以β折疊(25.86%)、無規(guī)則卷曲（50.00%）為主，占75.86%。通過Phyre2軟件和SWISS-Modle對KcFabZ蛋白3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測 (圖2a、圖2b)，KcFabZ蛋白在結(jié)構(gòu)上具有典型的α+β‘hot_dog'折疊模式。在對各物種FabZ基因100條序列的Motif分析中可以看出，KcFabZ蛋白在大部分氨基酸位都高度保守（圖2c）。

圖2 KcFabZ保守結(jié)構(gòu)域3D結(jié)構(gòu)和Motif注：aKcFabZ單體結(jié)構(gòu)圖；bKcFabZ六聚體結(jié)構(gòu)圖；cKcFabZMotif

用MEGA6等多序列比對軟件對花花柴及一些其他物種的FabZ基因編碼蛋白序列進(jìn)行比對（圖4a），并構(gòu)建進(jìn)化樹（圖3），KcFabZ基因進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，花花柴與萵苣親緣關(guān)系較近。利用NCBICDD分析基因蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域，KcFabZ基因具有典型的α+β‘hot_dog'折疊結(jié)構(gòu)，為表現(xiàn)為hot_dog超家族功能基因，有催化活性、代謝等功能（圖4b），KcFabZ基因亞細(xì)胞定位在葉綠體中。

圖3 KcFabZ與其他植物同源氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 KcFabZ的保守結(jié)構(gòu)域和功能域分析注：aKcFabZ保守結(jié)構(gòu)域；bKcFabZ功能域

2.3 熒光定量PCR分析

熒光定量PCR分析表明，KcFabZ在高溫脅迫的各個時間段均有表達(dá)（圖5），KcFabZ在高溫脅迫下處于上升趨勢，在8 h時表達(dá)量約是對照的20倍，在16 h后，表達(dá)量下降。說明高溫脅迫能夠誘導(dǎo)KcFabZ基因的表達(dá)。

圖5 KcFabZ基因在不同時間高溫處理下葉片中的表達(dá)分析

3 結(jié)論與討論

本研究首次在花花柴中克隆出KcFabZ基因，通過序列分析發(fā)現(xiàn)該基因具有典型FabZ功能結(jié)構(gòu)域和α+β‘hot_dog'折疊，為六聚體，通過Motif分析發(fā)現(xiàn)KcFabZ在大部分氨基酸都具有高度保守，這在酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化中起重要作用，在幽門螺桿菌中用圓二色光譜測量的酶表征和熱誘導(dǎo)解折疊證明了HpFabZ在高溫（90℃）下非常穩(wěn)定，源于HpFabZ六聚體之間的強(qiáng)H-鍵和疏水相互作用，更好地闡明了HpFabZ結(jié)構(gòu)的高穩(wěn)定性［4]。在同源比對中發(fā)現(xiàn)，KcFabZ與萵苣（Lactuca sativaLinn）、向日葵（Helianthus annuus）、青蒿（Artemisia annua）等物種的β-羥?；?ACP脫水酶同源性均達(dá)到75%以上，且與萵苣親緣關(guān)系最近，可能由于花花柴與萵苣同屬于菊科，具有物種同源性。

FabZ作為脂肪酸合成酶的一種，是脂肪酸碳鏈延長的關(guān)鍵酶，與FabI、FabG構(gòu)成了脂肪酸碳鏈延伸的循環(huán)體系，在脂肪酸合成途徑中發(fā)揮重要作用，如Bourgis［13]的研 究中高 油 分含量 的油桐（Vernicia fordii）中β-羥酰基-ACP脫水酶的表達(dá)量是椰棗（Phoenix dactylifera）中的8倍；在Tai［14]等的研究中就發(fā)現(xiàn)在云杉（Picea asperata Mast）脂肪酸從頭合成的脂肪酸合成酶中的FabZ的mRNA第一個內(nèi)含子存在可變剪接并且隨著溫度的降低再增加，表明β-羥?；?ACP脫水酶不僅在脂肪酸合成中發(fā)揮重要作用，對溫度還具有很高的敏感度。本研究通過qRT-PCR技術(shù)，以40℃高溫處理不同時間的花花柴培養(yǎng)植株為材料，發(fā)現(xiàn)在高溫處理下基因的表達(dá)模式均不同于常溫條件，表現(xiàn)出先增高后降低的變化趨勢，推測可能與高溫逆境處理相關(guān)。

研究表明，植物葉片表皮蠟質(zhì)在逆境脅迫響應(yīng)中起到重要作用，Zhu等［15]的研究中發(fā)現(xiàn)在干旱下誘導(dǎo)蠟質(zhì)積累的基因（DWA1）的突變體與野生材料相比對干旱脅迫高度敏感，可以通過調(diào)節(jié)水稻干旱誘導(dǎo)的表皮蠟沉積來控制抗旱性；吳洪啟等［16]發(fā)現(xiàn)干旱脅迫能夠誘導(dǎo)蠟質(zhì)合成相關(guān)基因β-酮脂酰-輔酶A合成酶表達(dá)量上調(diào)?；ɑú褡鳛橐环N荒漠植物，葉片較厚，表面附著一層厚厚的蠟質(zhì)，經(jīng)預(yù)測KcFabZ基因定位于花花柴葉器官的葉綠體中，葉綠體是質(zhì)體的一種，蠟質(zhì)合成的第一步是在質(zhì)體中合成長度為C16～C18的脂肪酸，第二步在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中長鏈脂肪酸進(jìn)行碳鏈的延伸，第三部超長鏈脂肪酸在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的修飾下形成醇類、酯類和烷烴等，故推測該基因與其葉表面蠟質(zhì)積累有關(guān)。到目前為止，針對脂肪酸基因抗逆性的研究重點(diǎn)在不飽和脂肪酸的去飽和酶上，對脂肪酸合成酶的碳鏈延長酶基因與植物抗逆性關(guān)系的研究報(bào)道較少。例如，在Wolter等［17]的研究中，將擬南芥（Arabidopsis thaliana）GPAT過表達(dá)會引起不飽和脂肪酸含量的增加，從而更適應(yīng)在低溫下生長，也有文獻(xiàn)表明，在擬南芥中膜脂肪酸的不飽和度與生長溫度成反比［18]，在低溫條件下小麥（Triticum aestivum L）中脂肪酸中α-亞麻酸（18：3）比例由于ω-3去飽和酶TaFAD3基因的作用隨著溫度的降低而增加［19]。Murakami等［20]克隆了編碼葉綠體ω-3脂肪酸去飽和酶的基因（其合成三烯脂肪酸），并在轉(zhuǎn)基因煙草（Nicotianatabacum）中沉默，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因材料更能適應(yīng)高溫環(huán)境。而關(guān)于FabZ基因的研究大部分在原核菌類上，在植物中鮮有報(bào)道，本研究通過RNA-seq分析對花花柴脂肪酸生物合成差異表達(dá)基因FabZ進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該基因在脂肪酸合成路徑中發(fā)揮重要作用并能對高溫處理有一定的響應(yīng)，將為探索花花柴耐高溫機(jī)制和研發(fā)耐高溫轉(zhuǎn)基因作物奠定了一定的理論基礎(chǔ)。