HPLC法同時測定康潰丸中黃芪甲苷藁本內(nèi)酯和黨參炔苷的含量

孫瑩瑩

摘要：目的 建立HPLC法同時測定康潰丸中黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、黨參炔苷的含量的方法。方法 采用高效液相色譜法，色譜條件：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）;混合流動相：流動相A為乙腈，流動相B為0.25 moL·L-1三氟乙酸水溶液，梯度洗脫;流速：1.0 mL·min-1;柱溫：28℃;進樣量：10μL;檢測波長：282nm。結(jié)果 黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、黨參炔苷檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為2.256～32.158 μg·mL-1，2.268～58.142 μg·mL-1，2.284～46.524 μg·mL-1。平均加樣回收率（RSD）分別為100.95（0.88）、99.42（1.06）、99.42（0.92）。結(jié)論 該方法簡單快速、準(zhǔn)確可靠、專屬性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均較好，為康潰丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供有意義的實驗基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：康潰丸;黃芪甲苷;藁本內(nèi)酯;黨參炔苷;HPLC

中圖分類號：R927.2 ? 文獻標(biāo)志碼：A ? 文章編號：1007-2349（2019）06-0078-04

【Abstract】Objective：To establish a HPLC method for simultaneous determination of the contents of astragaloside，ligustilide and codonopsis in Kangchuan Pills.Methods：HPLC was used with chromatographic conditions，Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm）.Mixed mobile phase：mobile phase A was acetonitrile and mobile phase B was 0.25 moL·L-1 aqueous solution of trifluoroacetic acid.gradient elution，1.0 mL·min-1 of flow rate，28°C of column temperature，10 μL of injection amount and 282 nm of detection wavelength.Results：The linear range of the detection quality concentration of astragaloside，ligustilide and ginsenoside were from 2.256 to 32.158 μg·mL-1，2.268 to 58.142 μg·mL-1 and 2.28 to 46.524 μg·mL-1，respectively.The average sample recovery（RSD）was 100.95（0.88），99.42（1.06），and 99.42（0.92），respectively.Conclusion：The method is simple，rapid，accurate and reliable，and has good specificity，precision，stability and repeatability and provides a meaningful experimental basis for the improvement of Kangkui Pill quality standard.

【Key words】Kangkui Pills，astragaloside，ligustilide，cognac glucoside，HPLC

康潰丸是南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬連云港醫(yī)院生產(chǎn)的醫(yī)療機構(gòu)藥物制劑，批準(zhǔn)文號：蘇藥制字Z04000051，該藥物由黃芪、當(dāng)歸、黨參、丹皮、赤芍、白芍、生地黃、麥冬、玄參、甘草等藥味制成，具有益氣養(yǎng)血、滋陰降火、清熱解毒、活血止痛生肌的功效，主治復(fù)發(fā)性口腔潰瘍。目前對康潰丸的質(zhì)量控制方法主要是薄層鑒別法，主要是對其含有的重要藥材進行定性鑒別，沒有對主要活性成分進行含量測定的方法，這對與康潰丸的質(zhì)量控制是十分不利的，所以，建立對康潰丸主要活性成分的含量測定方法，是該藥物質(zhì)量控制中亟待解決的技術(shù)問題?？禎⑼杼幏街?，黃芪為君藥，當(dāng)歸、黨參為臣藥，黃芪甲苷是黃芪中的含有的重要活性成分，藁本內(nèi)酯是當(dāng)歸中含有的重要活性成分，黨參炔苷是黨參中含有的重要活性成分，故建立高效液相色譜法對黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯和黨參炔苷三種指標(biāo)性活性成分進行含量測定，是一種有效控制康潰丸質(zhì)量的方法，筆者對此進行了研究，為更有效地控制康潰丸的質(zhì)量提出一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200型HPLC儀，包括四元泵、紫外可變波長檢測器、自動進樣器、ChemStation化學(xué)工作站（美國Agilent公司）;JA2003型電子天平（上海上天精密儀器有限公司）;KQ-800ES型高效能超聲波清洗器（蘇州江東精密儀器有限公司）;TG18-WS型臺式多功能高速離心機（長沙維爾康離心機有限公司）。

1.2 試藥 康潰丸，由黃芪、當(dāng)歸、黨參、丹皮、赤芍、白芍、生地黃、麥冬、玄參、甘草等藥味制成，由南京中醫(yī)藥大學(xué)連云港附屬醫(yī)院制備。黃芪甲苷對照品（批號：101106-201702）;藁本內(nèi)酯對照品（批號：121030-201703）;黨參炔苷對照品（批號：110521-201701），均購于中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純（Fisher公司）;三氟乙酸均為分析純（棗莊潤發(fā)化工有限公司）;水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）;混合流動相：流動相A為乙腈，流動相B為0.25 moL·L-1三氟乙酸水溶液，梯度洗脫，洗脫順序見表1;流速：1.0 mL·min-1;柱溫：28℃;進樣量：10μL;檢測波長：282nm。

2.2 混和對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品6.00 mg，藁本內(nèi)酯對照品12.00 mg，黨參炔苷對照品8.00 mg，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得黃芪甲苷對照品貯備液、藁本內(nèi)酯對照品貯備液、黨參炔苷對照品貯備液;分別精密量取3種對照品貯備液各2.0 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋定容，制成含黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、黨參炔苷質(zhì)量濃度分別為48.00 μg·mL-1、96.00 μg·mL-1、64.00 μg·mL-1的混和對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取康潰丸樣品20丸，研成細粉，稱取1.0 g，精密稱定后，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取，超聲功率：250 W，超聲頻率：40 kHz，超聲時間：40 min，冷卻后，以5000 r·min-1的速度，離心10 min，取上清液，用水飽和的正丁醇萃取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣用0.25 moL·L-1三氟乙酸水溶液溶解，定容至10 mL量瓶中，搖勻，離心5 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 陰性對照品溶液的制備 將康潰丸處方中黃芪、當(dāng)歸、黨參三味藥材原料去除后，再按照康潰丸的制備工藝制成不含黃芪、當(dāng)歸、黨參三味藥材原料的藥物，再按照本研究提供的供試品溶液的制備方法，制成即陰性供試品溶液。

2.5 專屬性試驗 取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，在本研究提供的色譜條件進樣測定，記錄高效液相色譜圖，結(jié)果見圖 1。實驗結(jié)果表明，陰性對照在與黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、黨參炔苷保留時間相同處無其他色譜峰的干擾，表明本實驗的專屬性良好。

2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液0.5 mL，1.0 mL，2.0 mL，4.0 mL，8.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入體積比為20：80的乙腈-0.25 moL·L-1三氟乙酸水溶液定容，制成系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各10 μL，在本研究提供的色譜條件下，注入高效液相色譜儀，進行測定，以黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、黨參炔苷的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、以高效液相色譜峰的峰面積面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，記錄色譜圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到線性回歸方程，見表2。

實驗結(jié)果表明：黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、黨參炔苷檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為2.256～32.158 μg·mL-1，2.268～58.142 μg·mL-1，2.284～46.524 μg·mL-1。

2.7 定量限與檢測限考察 分別精密量取混合對照品溶液適量，倍比稀釋，在本研究提供的色譜條件下，注入高效液相色譜儀，進行測定，當(dāng)信噪比為10：1時，得定量限;當(dāng)信噪比為2：1時，得檢測限。實驗結(jié)果得出，黃芪甲苷的定量限分別為2.438 μg·mL-1，檢測限為1.218 μg·mL-1;藁本內(nèi)酯的定量限分別為2.528 μg·mL-1，檢測限為1.324 μg·mL-1;黨參炔苷的定量限分別為2.446 μg·mL-1，檢測限為1.352 μg·mL-1。

2.8 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，在本研究提供的色譜條件下，在12 h內(nèi)連續(xù)進樣6次，進行測定，記錄高效液相色譜峰的峰面積。測得黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、黨參炔苷的峰面積自然對數(shù)RSD分別為0.387%、0.49%、0.65%，表明精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（批號：20180510）10 μL，在本研究提供的色譜條件下，分別于0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h進樣測定，記錄高效液相色譜峰的峰面積。測得黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、黨參炔苷峰面積自然對數(shù)RSD分別為0.68%、0.95%、0.74%（n=6），表明供試品溶液在室溫條件下，16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗 精密量取同一批號的康潰丸（批號：20180510）100丸，研細，將細粉均分為6份，按本研究提供的方法制備供試品溶液，在本研究提供的色譜條件下進樣10μL測定，記錄高效液相色譜峰的峰面積并計算含量。測得康潰丸中黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、黨參炔苷含量平均值分別為 245.85 μg·g-1、495.26 μg·g-1、370.58 μg·g-1，RSD分別為0.75%、0.84%、0.66%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的康潰丸（批號：20180510）6份，每份1.0 g，分別精密加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按本研究提供的方法制備成待測供試品溶液，在本研究提供的色譜條件下，進樣10 μL進行測定，記錄高效液相色譜峰的峰面積，并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.11 樣品含有量測定 取3批次的康潰丸，每批次精密稱取50 mL，按本研究提供的方法制備供試品溶液，在本研究提供的色譜條件下，精密吸取10 μL進樣測定，計算含量，平行3次，測定結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 供試品溶液制法的考察 參考相關(guān)文獻[1-3]，本研究以水、甲醇、0.25 moL·L-1三氟乙酸水溶液為提取溶劑，對超聲提取、回流提取進行了考察，并對萃取溶劑也進行了實驗，實驗結(jié)果表明，采用甲醇為溶劑，超聲提取時藁本內(nèi)酯的含量較回流提取時的含量高，這可能與藁本內(nèi)酯具有揮發(fā)性，回流提取可能有部分損失有關(guān)，故選擇甲醇為溶劑，超聲提取為本試驗的提取方法;分別考察了以水飽和的正丁醇萃取和以丙酮溶劑萃取，結(jié)果顯示，以水飽和的正丁醇萃取時，黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、黨參炔苷含量最高，色譜中雜質(zhì)峰最少，故確定水飽和的正丁醇為本試驗的萃取溶劑。

3.2 流動相的考察 考察了甲醇-水、乙腈-0.25 moL·L-1三氟乙酸水溶液、乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液等多種不同濃度和比例的流動相系統(tǒng)，實驗結(jié)果表明，以乙腈-0.25 moL·L-1三氟乙酸水溶液為流動相，梯度洗脫時，黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、黨參炔苷分離效果好，峰型對稱，出峰穩(wěn)定，干擾少，故采用乙腈-0.25 moL·L-1三氟乙酸水溶液為流動相體系。

3.3 檢測波長的考察 采用紫外可變波長檢測器200～380 nm范圍內(nèi)對黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、黨參炔苷這3個成分進行掃描，黃芪甲苷在306 nm、282 nm處有最大吸收，藁本內(nèi)酯在282 nm、334 nm處有最大吸收，黨參炔苷在281 nm、254 nm處有最大吸收，結(jié)合相關(guān)文獻[4-6]，當(dāng)檢測波長為282 nm時，黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、黨參炔苷這3個成分均有較大吸收峰，故選擇檢測波長選擇在282 nm。

4 結(jié)論

本實驗建立HPLC法同時測定康潰丸中黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、黨參炔苷的含量，該方法簡單快速、準(zhǔn)確可靠、專屬性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均較好，為康潰丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供有意義的實驗基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-03-19）