響應(yīng)面法優(yōu)化海參腸酶解工藝的研究*

岑萬，林君如，鐘佳澤，黃鷺強(qiáng)

（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117 2.福建師范大學(xué)南方海洋研究院，福建 福州 350117）

海參屬棘皮動物門(Echinodermata）海參綱(Holothuriodea)無脊椎動物[1]，目前已知全球約有 1500多種，有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海參有60多種[2]。海參是一種傳統(tǒng)的海珍品，含有豐富多樣的生物活性物質(zhì)[3]，如抗腫瘤物質(zhì)、抗凝血物質(zhì)、抗炎癥物質(zhì)等成分[4-6]，具有極高的藥用價(jià)值和食用價(jià)值，長期以來一直受到大眾的青睞。

海參的加工品多以海參體壁為主，內(nèi)臟主要是少量種類的性腺和腸等，同時(shí)海參腸也是一些品種海參加工過程中產(chǎn)生的大宗副產(chǎn)物。研究表明海參腸中含有多肽、多糖、酚類、黃酮類物質(zhì)和礦物質(zhì)，可清除自由基、抗菌活性、降血脂和血糖、增強(qiáng)免疫力[7]。本文以海參腸為研究對象，采用響應(yīng)面法研究海參腸的酶解工藝，以期為高值化利用海參提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

海參腸為海參加工副產(chǎn)物，由勝田（福清）食品有限公司提供。

1.2 試劑

木瓜蛋白酶（60000 U/g），廣州華琪生物有限公司；

氫氧化鈉、檸檬酸、甲醛均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

HC-2066高速離心機(jī)，安徽中科中佳；

HH-3A型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇易晨儀器；JJ-2組織搗碎勻漿機(jī)，常州國華；pH計(jì)，奧豪斯；

KDN-04A凱式定氮儀，上海力辰邦西。

1.4 方法

1.4.1 海參腸酶解工藝流程

海參腸→清洗去沙→組織搗碎→加酶處理→滅酶→冷卻離心→酶解液→低溫保存

1.4.2 操作步驟

⑴ 清洗：將冰凍的海參腸常溫解凍，然后進(jìn)行清洗，清洗過程中要注意除去沙粒等物質(zhì)，且避免海參腸自溶。

⑵ 組織搗碎：海參腸剪成小塊，搗碎勻漿。

⑶ 酶處理：參考周潔靜等[8]方法，準(zhǔn)確稱取50 g海參腸漿，置于500 mL燒杯中，按一定的料液比加水混勻，放入已恒溫的恒溫水浴鍋中，待料液達(dá)到一定溫度后加入1 g木瓜蛋白酶。充分?jǐn)噭颍⒄{(diào)節(jié)pH值至一定值。每隔2.5 h加酶一次，水解5 h后終止反應(yīng)。

⑷ 滅酶：將水解液快速升溫至90～100℃，并保持20 min。冷卻至室溫，在轉(zhuǎn)速為4000 r/min 下離心15 min，所得上清液即為海參酶解液粗產(chǎn)品。通過檢測蛋白質(zhì)水解度來衡量水解效果。

1.4.3 單因素試驗(yàn)

料液比（w∶w）：分別為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6，此時(shí)水解溫度為55 ℃，pH調(diào)至7.0；

pH：分別調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，此時(shí)料液比為1∶2，水解溫度為55 ℃；

水解溫度：分別為50、55、60、65、70 ℃，此時(shí)料液比為1∶2， pH調(diào)至7.0。

1.4.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別選取3組料液比、pH值和水解溫度，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)[9]。通過檢測蛋白質(zhì)水解度來衡量水解效果。

1.4.5 水解度的測定

參考王可琦等[10]方法，采用甲醛滴定法測定海參腸蛋白質(zhì)的水解度。

1.4.6 結(jié)果計(jì)算

A--游離氨基氮，mg/mL

V1--兩測定管氫氧化鈉用量的平均值，mL

V2--空白管氫氧化鈉的用量，mL

B--樣品體積，mL

M--樣品量，g

N--總氮含量

1.4.7 數(shù)據(jù)分析

本文的數(shù)據(jù)分析和繪圖采用Origin 8.5 軟件，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert.8.05b軟件設(shè)計(jì)并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果和繪圖。數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）。柱形圖上標(biāo)有不同字母表示在0.05 水平有顯著差異。

表1 水解度測定方案

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對海參腸酶解的影響

根據(jù)設(shè)定的不同料液比進(jìn)行海參腸酶解試驗(yàn)，通過甲醛滴定測定獲得水解度，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對海參腸酶解水解度的影響

由圖1可知，當(dāng)pH值和水解溫度恒定時(shí)，隨著料液比的升高，海參腸的水解度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。料液比為1∶3時(shí)水解度達(dá)到最高，料液比從1∶4到1∶6，海參腸的水解度呈下降趨勢。

2.1.2 pH值對海參腸酶解的影響

根據(jù)設(shè)定的不同pH值進(jìn)行海參腸酶解試驗(yàn)，通過甲醛滴定測定獲得水解度，結(jié)果見圖2。

圖2 pH值對海參腸酶解水解度的影響

由圖2可知，當(dāng)料液比和水解溫度恒定時(shí)，隨著pH值的升高海參腸的水解度呈現(xiàn)升高的趨勢。pH 5.5～6.5時(shí)水解度變化不顯著，當(dāng)pH值達(dá)到7.0時(shí)水解度達(dá)到最高，隨后水解度又呈下降趨勢。

2.1.3 水解溫度對海參腸酶解的影響

根據(jù)設(shè)定的不同溫度進(jìn)行海參腸酶解試驗(yàn)，通過甲醛滴定測定獲得水解度，結(jié)果見圖3。

圖3 水解溫度對海參腸酶解水解度的影響

由圖3可知，當(dāng)料液比和pH值恒定時(shí)，海參液的水解度隨著隨著水解溫度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。當(dāng)水解溫度達(dá)到60 ℃時(shí)解度達(dá)到最高，水解溫度在65～70 ℃海參腸水解度隨之下降。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 響應(yīng)面二次模型的方差分析結(jié)果

2.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，參照張曉曉等[11]方法，以料液比、pH值、水解溫度為自變量，以水解液的蛋白質(zhì)水解度為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，其結(jié)果見表2。

AVOVA分析結(jié)果見表3和表4。

表4 模型的可信度分析

運(yùn)用軟件進(jìn)行回歸擬合度分析，得到回歸方程：

從上述響應(yīng)面二次模型的方差分析結(jié)果可得，此次模型P值大于F值（＜0.05），由此可見本次構(gòu)建的模型是可信的；模型中P值小于0.05，說明此次三因素三水平的建模分析是可行的。從模型的可信度分析中可以看出，擬合度的值為0.9937，說明海參腸水解度變化有99.37%的可能是由于料液比、pH、水解溫度3個自變量改變所導(dǎo)致的。這說明料液比、pH與水解溫度直接影響海參水解度，得到的回歸方程是有效的，可以用來確定最優(yōu)的酶解工藝；本次實(shí)驗(yàn)的信噪比為34.171，遠(yuǎn)大于建模所需的信噪比4，說明本次實(shí)驗(yàn)建模成功可靠。由表3中F值可以看出，pH對于海參水解度影響最大，料液比其次，酶解溫度最小。

2.3 各響應(yīng)因子水平相互作用的分析

綜合料液比、pH和水解溫度三因素交互作用對水解度的影響，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果見圖4、圖5、圖6。

圖4 水解溫度和料液比對海參腸水解度的交互影響

由圖4可知，當(dāng)水解溫度一定時(shí)，隨著料液比的提高，海參腸水解度緩慢增大然后快速下降；當(dāng)料液比一定時(shí)，海參腸水解度隨著水解溫度的增大緩慢增大然后有下降的趨勢。

圖5 水解溫度和pH值對海參腸水解度的交互影響

由圖5可知，水解溫度不變時(shí)，隨著pH值的增大，酶解海參水解度緩慢增大；當(dāng)pH值不變時(shí)，酶解海參腸水解度隨著水解溫度的升高，先逐漸地增大而后出現(xiàn)緩慢下降趨勢。

圖6 pH值和料液比對海參腸水解度的影響

由圖6可知，pH值不變時(shí)，隨著料液比的增大，海參腸水解度緩慢增大而后呈現(xiàn)下降趨勢；當(dāng)料液比不變時(shí)，海參腸水解度隨著pH值的增大，呈現(xiàn)出上升趨勢。

圖4、圖5、圖6表明，海參腸水解度與料液比、pH值和水解溫度三個因素有關(guān)，且存在最佳參數(shù)組合使得膠原蛋白的提取率達(dá)到理論最大值。通過軟件進(jìn)行解方程組，得到海參腸的最佳工藝：料液比1∶4.43、pH值7.0、水解溫度62.61 ℃，海參腸水解度為56.46%。考慮到實(shí)際應(yīng)用的方便性，將工藝條件取為：料液比1∶4.4、pH值7.0、水解溫度63 ℃。

2.4 最優(yōu)條件的驗(yàn)證

根據(jù)優(yōu)化后的最佳工藝條件，即料液比1∶4.4、pH 7.0、水解溫度63 ℃，進(jìn)行3次水解試驗(yàn)，結(jié)果如表5所示，實(shí)際值與預(yù)測值相差不大，說明模型與實(shí)際情況吻合良好。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本文以海參腸為原材料研究其酶解最佳工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法建立了海參酶解工藝的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，分析了料液比、pH值和水解溫度三因素交互作用對酶解海參腸水解度的影響，得到最佳工藝條件為料液比1∶4.4、pH 7.0、水解溫度63 ℃。根據(jù)該工藝條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，得到實(shí)際水解度平均值為(55.26±0.71)%，證實(shí)模型與實(shí)際情況吻合良好。

李冬燕等[12]采用雙酶復(fù)合進(jìn)行海參腸酶解，同時(shí)考慮料液比、加酶量和水解時(shí)間，在最優(yōu)條件下水解度最大可達(dá) 55.76 %，而采用分階段加酶工藝，水解度高達(dá)88.08%[13]，說明水解度還能進(jìn)一步提高，應(yīng)考慮更多因素開展進(jìn)一步試驗(yàn)。酶解工藝可最大限度保留海參腸的營養(yǎng)成分，提高產(chǎn)品質(zhì)量，具有能耗低和污染少的優(yōu)點(diǎn)，但在實(shí)際生產(chǎn)中，酶的選擇應(yīng)考慮水解率、操作難易、成本等因素。海參腸蛋白質(zhì)含量為52.27%，粗脂肪含量為15.98%[14]，開發(fā)海參腸相關(guān)產(chǎn)品的研究報(bào)道不多，因此充分開發(fā)利用海參腸很有必要，既能避免環(huán)境污染又能提高經(jīng)濟(jì)效益。