冷凍干燥法制備聚乳酸多孔支架

尹浩月，鄧久鵬，馬麗娟，田宜文

（華北理工大學(xué)口腔修復(fù)科，河北唐山 063000）

1 引 言

由腫瘤、外傷、交通事故等造成的口腔頜面部骨組織缺損是臨床常見癥狀之一，如何修復(fù)大量骨缺損一直是臨床治療的難題[1-2]。為了更好地解決這一問題，制備出具有三維多孔支架作為骨組織替代品的骨組織工程技術(shù)受到廣泛的關(guān)注[3]。目前，應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域的材料主要包括金屬、陶瓷、高分子聚合物和復(fù)合材料[4]，雖然研究人員已經(jīng)做了大量的實(shí)驗(yàn)，但是目前為止尚未制備出一種可以完全替代人類骨骼的理想的骨移植材料[5]。聚乳酸（PLA）具有良好的機(jī)械和物理性能以及優(yōu)異的生物相容性，是目前被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于醫(yī)療用途的少數(shù)聚合物之一，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)療領(lǐng)域[6]。本實(shí)驗(yàn)采用冷凍干燥法，制備PLA多孔支架，為組織工程的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料和儀器

聚乳酸（PLA，美國(guó)）；1，4-二氧六環(huán)（分析純，天津）；二氯甲烷（分析純，天津）；無水乙醇（分析純，天津）；L929細(xì)胞株（上海細(xì)胞庫提供）；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)）；PBS緩沖液；噻唑藍(lán)（MTT，Sigema，美國(guó)）；二甲基亞砜（DMSO，Sigema，美國(guó)）；酶標(biāo)儀（上海永創(chuàng)）；冷凍干燥機(jī)（比朗，上海）；掃描電子顯微鏡（S-4800，日本）；電子萬能試驗(yàn)機(jī)（AGS-X，日本）。

2.2 方法及分組

2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將1，4-二氧六環(huán)與二氯甲烷按體積比隨機(jī)分為3組（n=5）：A組，95：5；B組，90：10；C組，85：15。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 將0.5 g PLA在60℃真空干燥箱內(nèi)充分干燥24 h后加入到4 mL有機(jī)溶劑（1，4-二氧六環(huán)/二氯甲烷，v/v）中，有機(jī)溶劑按體積比分為3組（n=5），見2.2.1。恒溫?cái)嚢柚镣该魅芤汉?，放?20℃冰箱內(nèi)冷凍1 h后，冷凍干燥24 h。將樣品放入無水乙醇中浸泡24 h，鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥24 h后，檢測(cè)樣品的表面形貌、孔隙率、壓縮強(qiáng)度及細(xì)胞毒性。

2.2.3 PLA多孔支架材料浸提液制備 浸提標(biāo)本為本實(shí)驗(yàn)所制備的支架材料，樣品經(jīng)過紫外線照射72 h滅菌后，按重量與含有10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基體積比為0.1 g：1 mL比例浸潤(rùn)，于37℃恒溫箱中靜置48 h，取出材料過濾除菌，獲取浸提液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 評(píng)價(jià)方法

2.3.1 支架形貌觀察 采用掃描電鏡（S-4800，日本日立）對(duì)支架表面形貌進(jìn)行觀察，孔徑大小及連通性。

2.3.2 孔隙率的檢測(cè) 采用重量法測(cè)量復(fù)合多孔支架的孔隙率，每組測(cè)試樣品3個(gè)，計(jì)算公式如下：

式中ε為支架孔隙率；WS為支架質(zhì)量；W1為比重瓶裝滿乙醇后的總質(zhì)量；W2為組織支架完全排出氣泡后充滿乙醇后的質(zhì)量；W3為把支架從乙醇中取出后剩余物的總質(zhì)量。

2.3.3 力學(xué)性能的檢測(cè) 采用萬能試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行抗壓強(qiáng)度的測(cè)試。將樣品切割成直徑10 mm，高10 mm的圓柱體，按照GB-T 1041-1992的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試多孔支架的壓縮強(qiáng)度。加載速度為5 mm/min，每組試件為3個(gè)樣品。

2.3.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞制備成密度為1×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100μL，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗滌2次。實(shí)驗(yàn)組分別加入100μL浸提液，陰性對(duì)照組加入100μL完全培養(yǎng)基，陽性對(duì)照組加入0.64%苯酚溶液，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別設(shè)置5個(gè)副孔，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至1、3和5 d后，加入20μL MTT液，培養(yǎng)4 h后棄去原培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，低速搖床避光震蕩10 min，用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度（A）值，取平均值。

2.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，用±s表示多組間比較，采用方差分析并進(jìn)行兩兩比較。方差齊用LSD檢驗(yàn)，方差不齊則用Dunnett'sT3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 掃描電鏡觀察結(jié)果

圖1為放大200倍的掃描電鏡圖。由圖可知，采用真空冷凍干燥法可以制備出PLA多孔支架材料。PLA多孔支架材料具有大小不一的孔隙結(jié)構(gòu)，孔徑大小在10～200μm之間，孔隙連通性良好。圖1（a）為A組掃描電鏡圖，孔主要為長(zhǎng)圓形和圓形，孔徑大小不一，孔隙較密，但是有封閉孔隙存在；圖1（b）為B組掃描電鏡圖，圖中孔主要為長(zhǎng)橢圓形；圖1（c）為C組掃描電鏡圖，圖中大孔的孔壁上面存在較多的小孔，孔壁粗糙。

圖2為放大500倍的掃描電鏡圖。圖2（a）為A組掃描電鏡圖，圖中孔徑較大，孔壁較粗糙，但存在封閉式的孔隙；圖2（b）為B組掃描電鏡圖，圖中孔徑主要有圓形和橢圓形，孔壁凹凸不平，孔壁內(nèi)有小孔；圖2（c）為C組掃描電鏡圖，圖中孔徑較均勻，孔壁粗糙，孔壁內(nèi)小孔數(shù)量較多。

圖1 PLA支架SEM 圖（×200）Fig 1 SEM images of PLA scaffolds（×200）

圖2 PLA支架SEM 圖（×500）Fig 2 SEM images of PLA scaffolds（×500）

3.2 孔隙率測(cè)定結(jié)果

表1為PLA多孔支架材料孔隙率的測(cè)定結(jié)果。由表1可以看出，采用冷凍干燥法制備出的PLA多孔支架材料的孔隙率在（68.97±0.12）%～（73.75±0.47）%之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 PLA支架孔隙率Table 1 Porosity of PLA scaffolds

3.3 抗壓強(qiáng)度測(cè)試結(jié)果

由表2可以看出，PLA多孔支架材料的平均抗壓強(qiáng)度在（2.90±0.53）～（4.11±0.05）MPa之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3.4 細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞毒性檢測(cè)顯示（見圖3），在觀察期間內(nèi)陰性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增值良好，而陽性對(duì)照組細(xì)胞幾乎不增長(zhǎng)，表明支架材料未顯示出任何毒性，符合體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的要求。

表2 PLA支架的抗壓強(qiáng)度Table 2 Compressive strength of PLA scaffolds

圖3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況Fig 3 Cell proliferation detected by MTT method

4 討論

在組織工程中，支架材料主要作為骨修復(fù)中支持細(xì)胞生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換的初始結(jié)構(gòu)，理想的支架材料除了具有生物相容性、可降解性和良好的力學(xué)性能，還應(yīng)具有較高的孔隙率，孔隙介于100～800μm之間的孔隙率高達(dá)50%及以上，為細(xì)胞粘連和生長(zhǎng)以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換提供了微觀環(huán)境，并且在松質(zhì)骨的范圍內(nèi)具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度[7-8]。

聚乳酸（PLA）又名聚丙交酯，化學(xué)式為（C3H6O3）n是一種在生物體內(nèi)可完全降解為二氧化碳和水的高分子材料，因其具有低密度，易加工，良好的機(jī)械性能及生物相容性，獨(dú)特的抗菌作用以及電活性特性，與人骨相似，再加之來源廣泛等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞，被廣泛應(yīng)用于生物組織工程醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)以PLA為原料制備出的組織支架，應(yīng)用掃描電鏡觀察具有三維孔隙結(jié)構(gòu)。由圖2可以看出，大孔孔內(nèi)壁粗糙不平不僅增加了比表面積，更有利于細(xì)胞的粘附及生長(zhǎng)；微孔的存在賦予了支架良好的孔連通性，微孔形成的通道更有利于組織營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸以及細(xì)胞代謝產(chǎn)物的交換。微孔的存在同樣可以影響支架應(yīng)力的大小和分布，進(jìn)而影響支架的承重能力。孔隙率檢測(cè)結(jié)果顯示（見表1），制備的PLA多孔復(fù)合支架材料孔隙率在（68.97±0.12）% ～（73.75±0.47）%，強(qiáng)度在（2.90±0.53）～（4.11±0.05）MPa，滿足天然松質(zhì)骨機(jī)械強(qiáng)度的基本要求[11]。由表1可知，隨著孔隙率的升高，抗壓強(qiáng)度逐漸降低。這是由于孔隙的增加導(dǎo)致了支架材料實(shí)體體積的減小，進(jìn)而減少了支架材料的承重面積，由此可見，孔隙率的增加直接影響了抗壓強(qiáng)度的大小，導(dǎo)致支架材料的抗壓強(qiáng)度降低，蔣學(xué)泉等[12]的研究也得出了類似的結(jié)果。林建華[13]和徐文峰[14]同樣采用冷凍干燥法制備聚乳酸支架材料，在體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯示支架材料具有良好的細(xì)胞相容性，符合支架材料安全無毒的基本要求。

當(dāng)前，制備多孔支架材料的技術(shù)主要包括溶劑澆鑄/粒子瀝慮、相分離技術(shù)、冷凍干燥技術(shù)以及氣體發(fā)泡技術(shù)等[15]。冷凍干燥技術(shù)的原理是將聚合物溶液與水或有機(jī)溶液在低溫條件下冷凍結(jié)晶而得到聚合物相和溶劑固相，進(jìn)而在真空條件下使溶劑固相升華去除溶劑得到多孔結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)所用的有機(jī)溶劑因低溫冷凍結(jié)晶溫度的不同而形成相分離，致使在低溫條件下溶劑結(jié)晶與聚合物形成固液相分離，然后在溶劑結(jié)晶點(diǎn)溫度以下真空去除溶劑，從而形成多孔結(jié)構(gòu)。相比較于其它方法，冷凍干燥技術(shù)主要有以下優(yōu)點(diǎn)：在制備支架過程中最大限度的保留了材料原有的理化性能；致孔劑為有機(jī)溶劑而并非氯化鈉、冰粒子和糖球等顆粒狀物質(zhì)，有效避免了致孔劑的殘留，減少了封閉孔隙的出現(xiàn)；制備工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，效率高等。根據(jù)有關(guān)報(bào)道顯示，采用冷凍干燥技術(shù)制備的支架材料對(duì)生物活性并不產(chǎn)生負(fù)面影響[16]，本研究的體外細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果也證明這一點(diǎn)。

本研究采用真空冷凍干燥技術(shù)成功制備出符合骨組織要求的PLA多孔支架材料。