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    評估精子濃度常用儀器準(zhǔn)確性評價方法研究

    2019-07-30 07:13:56王曉尉谷翊群周芳梁小薇許劍鋒盧文紅
    生殖醫(yī)學(xué)雜志 2019年7期
    關(guān)鍵詞:精液精子計數(shù)

    王曉尉,谷翊群,周芳,梁小薇,許劍鋒,盧文紅

    (國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所,北京 100081)

    精液參數(shù)是診斷男性疾病、以及治療效果評價的重要指標(biāo)之一,同時也對評估男性生育力有著重要作用。多年來,精液參數(shù)評估方法多、技術(shù)要求高,操作很難標(biāo)準(zhǔn)化。因此,各個男科實驗室以及相關(guān)機(jī)構(gòu)都對自己的人員進(jìn)行實驗室操作的內(nèi)部質(zhì)量控制,以保證實驗人員操作技術(shù)規(guī)范、檢驗結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性。

    雖然,各個實驗室對于人員操作技術(shù)的規(guī)范相當(dāng)重視,但卻經(jīng)常忽略相關(guān)實驗儀器準(zhǔn)確性的校準(zhǔn)。誤差的來源并不完全來自于操作者本身,儀器的誤差也是檢測結(jié)果誤差的來源之一,尤其是現(xiàn)在各大三甲醫(yī)院幾乎都在使用計算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(CASA),對于儀器的準(zhǔn)確性判斷更是勢在必行。

    精子濃度一直是精液常規(guī)檢測中問題比較大的一個指標(biāo)。Makler計數(shù)板和CASA是實驗室最常用的兩個計數(shù)精子的儀器,但是經(jīng)過長期使用的Makler計數(shù)板,其腔室容積會發(fā)生變化,CASA對于精子的捕捉是否準(zhǔn)確,這些都是我們在實驗中無法預(yù)知的,并且這些因素都有可能對我們的實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。根據(jù)《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第五版手冊相關(guān)質(zhì)控方法的介紹,我們總結(jié)了一些評估方法,探討這些方法能否評估儀器的準(zhǔn)確性。

    資料與方法

    一、研究對象

    精液樣本:北京人類精子庫20例新鮮志愿者精液樣本。樣本采集見文獻(xiàn)[1]。所有志愿者簽署知情同意書。

    混合精液質(zhì)控品:對收集的液化和粘稠度都正常的精液樣本進(jìn)行充分混勻后,分裝成10支,每支500 μl,作為濃度的質(zhì)控樣本。

    質(zhì)控珠:QC-BeadsTM質(zhì)控珠(Bioscreen,美國)。

    二、研究方法

    1.精子濃度計數(shù)要求:利用改良Neubauer計數(shù)板、Makler計數(shù)板進(jìn)行人工分析,以及用CASA進(jìn)行自動分析。其中利用改良Neubauer計數(shù)板計數(shù)精子遵循《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第五版(以下簡稱“第五版”手冊)的要求進(jìn)行,Makler計數(shù)板和CASA計數(shù)則遵循儀器使用規(guī)范的要求進(jìn)行計數(shù),CASA計數(shù)時所用的載體為自帶的10 μl深計數(shù)池。具體實驗操作的技術(shù)員必須經(jīng)過第五版手冊相關(guān)技術(shù)的培訓(xùn),并能夠熟練使用改良Neubauer計數(shù)板、Makler計數(shù)板以及CASA對精子進(jìn)行計數(shù)。

    2.混合精液質(zhì)控品評估:分別用改良Neubauer計數(shù)板、全新購置的Makler計數(shù)板(簡稱“新Makler計數(shù)板”)和使用超過7年的Makler計數(shù)板(簡稱“舊Makler計數(shù)板”)進(jìn)行評估,將改良Neubauer計數(shù)板評估的精子濃度值作為標(biāo)準(zhǔn),分別和新舊Makler計數(shù)板所及結(jié)果進(jìn)行比較。

    3.質(zhì)控珠評估:利用新Makler計數(shù)板和舊Makler計數(shù)板分別對高(53~67×106/ml)、低濃度(25~34×106/ml)質(zhì)控珠樣本分別進(jìn)行評估,評估得到的結(jié)果與質(zhì)控珠給定的靶值范圍繪制Youden圖[2],并對新、舊Makler計數(shù)板評估結(jié)果進(jìn)行對比。

    4.多份新鮮精液樣本評估:利用改良Neubauer計數(shù)板、Makler計數(shù)板以及CASA對20份新鮮精液樣本的濃度進(jìn)行評估,將改良Neubauer計數(shù)板評估的濃度值作為標(biāo)準(zhǔn),所得到的結(jié)果繪制Bland-Altman圖[3-4]。

    5.評估準(zhǔn)確性控制:進(jìn)行混合精液樣本和質(zhì)控珠的評估時,為了減少人為因素引入的誤差,每次檢測都要進(jìn)行兩次計數(shù),并進(jìn)行差異的一致性檢驗。對每個樣本要進(jìn)行多次(不少于10次)的檢測。多份新鮮精液樣本的評估[1],每份樣本檢測都要進(jìn)行兩次計數(shù),并進(jìn)行差異一致性檢驗。

    三、統(tǒng)計學(xué)分析

    采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。利用單因素方差分析、Youden圖、Bland-Altman圖以及配對t檢驗對新舊Makler計數(shù)板以及CASA檢測的濃度結(jié)果進(jìn)行分析,并檢測差異性結(jié)果。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、不同計數(shù)板對混合精液質(zhì)控品的計數(shù)結(jié)果

    統(tǒng)計結(jié)果顯示,不同計數(shù)板對同一份混合精液質(zhì)控品的濃度連續(xù)檢測結(jié)果變異系數(shù)(CV)均小于10%;與舊Makler計數(shù)板相比,新Makler計數(shù)板(P=0.006)和改良Neubauer計數(shù)板(P=0.03)均有顯著性差異,而改良Neubauer計數(shù)板與新Makler計數(shù)板沒有顯著性差異(P=1.0)(表1)。

    表1 不同計數(shù)板對同一份混合精液質(zhì)控品連續(xù)進(jìn)行10次評估結(jié)果(×106/ml)和單因素方差分析結(jié)果

    注:與舊Makler計數(shù)板相比,*P<0.05

    二、質(zhì)控珠計數(shù)結(jié)果

    統(tǒng)計結(jié)果顯示,濃度連續(xù)濃度計數(shù)結(jié)果變異系數(shù)(CV)均小于10%,不論是高濃度(P=0.002 5)還是低濃度(P=0.009),新、舊兩個計數(shù)板所評估的結(jié)果都有顯著性差異(表2)。根據(jù)質(zhì)控珠給定的靶值范圍,繪制Youden圖,可以看出有部分點(diǎn)偏出了靶值范圍,但是,所有點(diǎn)的分布相對比較集中,散點(diǎn)偏離靶值范圍的距離并不遠(yuǎn)(圖2)。

    表2 不同計數(shù)板對同一份質(zhì)控珠樣本連續(xù)進(jìn)行10次評估結(jié)果(×106/ml)和單因素方差分析

    注:與同濃度新Makler計數(shù)板相比,*P<0.05

    圖1 顯微鏡下改良Neubauer計數(shù)板計數(shù)質(zhì)控珠

    ●圓點(diǎn)代表新Makler計數(shù)板評估結(jié)果;▲三角代表舊Makler計數(shù)板評估結(jié)果圖2 新、舊Makler計數(shù)板評估質(zhì)控珠結(jié)果的Youden圖

    三、20份新鮮精液樣本評估結(jié)果

    A:改良繪制方法;B:傳統(tǒng)繪制方法圖3 改良Neubauer計數(shù)板vs. 舊Makler計數(shù)板的精子濃度計數(shù)Bland-Altman圖

    A:改良繪制方法;B:傳統(tǒng)繪制方法圖4 改良Neubauer計數(shù)板vs. CASA精子濃度計數(shù)的Bland-Altman圖

    對20份新鮮精液樣本計數(shù)進(jìn)行配對t檢驗,結(jié)果顯示與改良Neubauer計數(shù)板相比,舊Makler計數(shù)板沒有顯著性差異(P>0.05),CASA有顯著性差異(P<0.05)(表3)。驗證了Bland-Altman圖改進(jìn)方法判斷的準(zhǔn)確性。

    表3 改良Neubauer計數(shù)板、舊Makler計數(shù)板和CASA對20份樣本檢測結(jié)果(×106/ml)

    注:與改良Neubauer計數(shù)板相比,*P<0.05

    討 論

    文中實驗均依據(jù)第五版手冊要求進(jìn)行操作,其中改良Neubauer計數(shù)板評估濃度按照第五版計數(shù)方法要求完成,Makler計數(shù)板和CASA則按照相關(guān)規(guī)則進(jìn)行計數(shù),但也要按照手冊要求每次或每個樣本至少計數(shù)兩次,并進(jìn)行一致性分析。

    通常男科實驗室進(jìn)行校準(zhǔn)設(shè)備所用的質(zhì)控樣本有兩種,一個是質(zhì)控珠,另一個是自制的精液質(zhì)控品。對于兩種質(zhì)控品對設(shè)備準(zhǔn)確性評估效果,我們在實驗中做了對比。為保證實驗準(zhǔn)確性,我們每個濃度都進(jìn)行重復(fù)10次檢測,以減少實驗人員操作所帶來的誤差。在用自制的混合精液質(zhì)控品中,以改良Neubauer計數(shù)板評估結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn),評估結(jié)果進(jìn)行One-way ANOVA進(jìn)行分析 (表1)。而質(zhì)控珠結(jié)果也同樣方法進(jìn)行計數(shù)(表 2),但我們并沒有對比改良Neubauer計數(shù)板的結(jié)果。首先,質(zhì)控珠直徑較小,在計數(shù)板內(nèi)長時間不沉降(圖1),導(dǎo)致無法準(zhǔn)確計數(shù)。其次,質(zhì)控珠本身給定了靶值范圍,沒必要再用改良Neubauer計數(shù)板計算質(zhì)控區(qū)間。從實驗結(jié)果上看,無論是使用質(zhì)控珠還是自制精液質(zhì)控品,新、舊Makler計數(shù)板計數(shù)結(jié)果對比都有顯著差異。而用自制精液質(zhì)控品,新Makler計數(shù)板與改良Neubauer計數(shù)板計數(shù)濃度結(jié)果卻沒有顯著差異。陸金春等[17]學(xué)者發(fā)現(xiàn)在精子濃度分析中,精子計數(shù)池的深度非常關(guān)鍵,使用不合格的計數(shù)板,將導(dǎo)致檢測結(jié)果產(chǎn)生誤差,這種誤差和計數(shù)板深度誤差成正比。因此我們推斷,Makler計數(shù)板長期使用其準(zhǔn)確度是有一定變化的。

    實驗中我們還發(fā)現(xiàn),由于質(zhì)控珠給定的靶值范圍偏大,雖然舊Makler計數(shù)板計數(shù)濃度結(jié)果有部分不在靶值范圍內(nèi),但新、舊計數(shù)板計數(shù)結(jié)果在Youden圖(圖2)中的點(diǎn)卻很集中,并且超出靶值范圍并不遠(yuǎn),從圖中我們并不能明顯看出兩塊計數(shù)板計數(shù)結(jié)果的差異,但是從統(tǒng)計結(jié)果上看(表2)卻有顯著性差異。因此,我們更推薦男科實驗室用自制的混合精液質(zhì)控品進(jìn)行Makler計數(shù)板的質(zhì)控。自制質(zhì)控品成本很低,而且容易獲得,可以利用改良Neubauer計數(shù)板做靶值范圍進(jìn)行質(zhì)控,但是在使用過程中要注意分裝和取樣時精液要混勻。若需要用質(zhì)控珠進(jìn)行評估,必須配合相應(yīng)的統(tǒng)計學(xué)分析,而不能直接使用給定靶值范圍。

    Bland-Altman方法是一種介于定量和定性之間的方法,它可以用于判斷兩種方法或兩個人測量結(jié)果的一致性。WHO第五版手冊里推薦用此種方法分析和報告2名技術(shù)員之間的差異。這種方法最大的好處就是采用圖示的方法,很直觀的顯示出判斷結(jié)果。但是,很多人都忽略了Bland-Altman方法是有適用條件的[5]。對于傳統(tǒng)的繪制方法,首先,差值的平均趨勢在測量范圍內(nèi)保持不變,表現(xiàn)為圖中散點(diǎn)分布與X軸平行;第二,差值的散布程度在測量范圍內(nèi)保持一致,表現(xiàn)為圖中的散點(diǎn)分布在同寬的離散帶內(nèi),即方差齊同;第三,差值的分布呈正態(tài)分布[6]。只有滿足這三個條件,我們才能認(rèn)為數(shù)據(jù)是良好的。否則直接使用Bland-Altman方法,不但得不到我們想要的真實結(jié)果,反而浪費(fèi)了大量的數(shù)據(jù)[7,12]。

    從上述實驗結(jié)果顯示,對于Bland-Altman方法改進(jìn)是有一定效果的,但是前提是確保我們改進(jìn)后的方法也要滿足Bland-Altman方法的使用條件,該方法的使用要靈活、要符合本行業(yè)的實際情況[13-16],切不可生搬硬套。

    Makler計數(shù)板作為男科實驗室常用的手工計數(shù)工具,很少有人關(guān)注其腔室深度的變化對精子計數(shù)結(jié)果的影響,而國內(nèi)只有陸金春等[17]少數(shù)學(xué)者用Geoffrey精子計數(shù)池證明了二者的相關(guān)性。但是,實驗只用了質(zhì)控珠,而沒有用精液樣本,因此,其結(jié)果有一定的局限性。我們用兩種質(zhì)控品進(jìn)行了對比,用實驗數(shù)據(jù)更全面的闡述了哪種質(zhì)控品更適合男科實驗室。CASA對比手工實驗的結(jié)果,國內(nèi)做的很多[18-20],大多數(shù)用統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析得到結(jié)果,雖然結(jié)果有說服力,但是不夠直觀,也無法顯示更多細(xì)節(jié),例如,有多少組數(shù)據(jù)偏差比較大,CASA在哪個濃度范圍內(nèi)測量比較準(zhǔn)確等數(shù)據(jù)。Bland-Altman圖在治療方法和試劑盒檢測結(jié)果對比方面應(yīng)用非常廣泛[13],但是,在男科領(lǐng)域目前國內(nèi)很少引用這種方法,盧文紅等[2]將這種方法引入男科實驗室人員質(zhì)控,而利用這種方法對儀器進(jìn)行質(zhì)控和校準(zhǔn)的,國內(nèi)目前還是空白,我們希望通過這些方法能夠為廣大的男科實驗室人員對相應(yīng)的儀器質(zhì)控和校準(zhǔn)提供方法上的借鑒。

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