高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定酒中6種對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑

趙靈芝，黃笑晨，花中霞，秦江芬，楊莉麗，王可，，

（1．河北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024；2．石家莊市疾病預(yù)防控制中心，河北 石家莊 050011）

作為一類常用的防腐劑，對(duì)羥基苯甲酸酯（p arabens，PBs）又稱尼鉑金酯[1]，主要包括對(duì)羥基苯甲酸甲酯（methylparaben，MHB）、對(duì)羥基苯甲酸乙酯（ethylparaben，EHB）、對(duì)羥基苯甲酸丙酯（propylparaben，PHB）、對(duì)羥基苯甲酸異丙酯（isoppylparaben，IPHB）、對(duì)羥基苯甲酸丁酯（butylparaben，BHB）、對(duì)羥基苯甲酸異丁酯（isobutylparaben，IBHB）[2]。與其它類的防腐劑相比較，對(duì)羥基苯甲酸酯因具有低毒安全、強(qiáng)殺菌和防腐能力、在較寬的pH 值范圍內(nèi)有良好的抗菌性能[3]，而被廣泛應(yīng)用于食品[4-5]、藥品[6-7]、化妝品及個(gè)人護(hù)理品[8]。盡管如此，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)羥基苯甲酸酯具有一定的雌激素活性和生殖毒性，能夠影響內(nèi)源性雌激素的代謝，導(dǎo)致線粒體功能障礙[9-10]；且相關(guān)研究表明其具有一定的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，并與男性不育及乳腺癌的發(fā)生存在一定關(guān)系[11]。目前，我國GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定了十余種食品中對(duì)羥基苯甲酸酯的最大使用限量（以對(duì)羥基苯甲酸計(jì)）不超過0.25 g/kg，經(jīng)表面處理過的新鮮水果及蔬菜不超過0.012 g/kg。

迄今為止，食品中對(duì)羥基苯甲酸酯的檢測(cè)方法主要包括氣相色譜法（gas chromatography，GC）[12-13]、膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳色譜法（micellar electrokinetic capillary electrophoresis chromatography，MECC）[14]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[15]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[16]等。其中，相比于其它幾種檢測(cè)方法，LC-MS/MS法具有靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確、可實(shí)現(xiàn)多種物質(zhì)痕量測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，在多分析物檢測(cè)方面應(yīng)用廣泛。目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)關(guān)于食品中對(duì)羥基苯甲酸酯的檢測(cè)多為其中的對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯，且檢測(cè)對(duì)象主要包括了調(diào)味品、醬腌菜、即食食品、鮮水果及果蔬汁，而關(guān)于酒中6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的檢測(cè)研究還未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過對(duì)前處理方法、色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS） 同時(shí)測(cè)定酒中6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的檢測(cè)方法，旨在為開展酒中防腐劑的檢測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，加強(qiáng)質(zhì)量監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料與試劑

MHB、IPHB、PHB（純度均大于 98.0 %）：德國 Dr.Ehrenstorfer 公司；IBHB（純度 99.0%）：日本東京化學(xué)試劑公司；BHB（純度99.0%）：天津科密歐化學(xué)有限公司；EHB（純度大于99.0%）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇（色譜純）：美國Fisher 公司；甲酸、甲酸銨（色譜純）：美國Dikma 公司；試驗(yàn)用水為Milli-Q 超純水。所測(cè)白酒、紅酒、啤酒、黃酒、果酒和米酒樣品購于石家莊市區(qū)超市。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200-6410B 高效液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有ESI 離子源）：美國Agilent 科技有限公司；Mettler-Toledo AE240 電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；C3I 型臺(tái)式離心機(jī)：法國Jouan 公司；MS3 渦旋振蕩器：德國 IKA 公司；N-EVAP-111 氮吹儀：美國Organomation 公司；Milli-Q 超純水機(jī)：美國Millipore公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量 MHB、EHB、PHB、IPHB、BHB和IBHB 6 種標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解配制1 g/L 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存于-20 ℃冰箱備用。取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用含有25%乙腈的水溶液稀釋，得到1 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)液。采用空白基質(zhì)提取液稀釋，配制 5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 μg/L 系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.0 g（精確至0.01 g）樣品于50.0 mL 離心管中，分別加入1.0 mL 2 mol/L 甲酸銨和10.0 mL 乙酸乙酯，渦旋30 s，超聲提取5 min，然后加入0.5 g 氯化鈉，渦旋混勻，以8 000 r/min 離心5 min。移取乙酸乙酯層，再加入10.0 mL 乙酸乙酯進(jìn)行二次提取，合并兩次提取液并用乙酸乙酯定容至20.0 mL，取2.0 mL 提取液在 45 ℃下氮?dú)獯蹈伞Ｓ?1.0 mL 乙腈-水（25 ∶75，體積比）溶解，過 0.2 μm 濾膜，待 HPLC-MS/MS 分析。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×75 mm，2.7 μm）；流速：0.4 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相：乙腈 -0.1%甲酸（體積分?jǐn)?shù)）水溶液（25 ∶75，體積比）；等度洗脫。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（electrospray ionization source，ESI），負(fù)離子掃描模式；干燥氣：氮?dú)?；干燥氣溫度?50 ℃；干燥氣流速：10 L/min；毛細(xì)管電壓：4 000 v；霧化氣壓力：103.4 kPa；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

對(duì)羥基苯甲酸酯的結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，容易失去H+，以[M-H]-形式存在。因此，選擇ESI 負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。通過全掃描模式得出其母離子[M-H]-，6 種分析物先后通過選擇性離子掃描模式得到相對(duì)應(yīng)的碎裂電壓，然后通過子離子掃描模式獲得定性離子對(duì)，同時(shí)優(yōu)化碰撞能。以豐度較大的兩個(gè)碎片離子作為各對(duì)羥基苯甲酸酯的定性離子，其中相對(duì)豐度最大的子離子作為定量離子。6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of 6 PBs

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)分別以甲醇-水和乙腈-水為流動(dòng)相，先后嘗試了 XDB-C18，Eclipse plus C18，WCX-1，Poroshell 120 Hilic 及Poroshell 120 EC-C18 5 款色譜柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有機(jī)相為乙腈時(shí)，6 種化合物的響應(yīng)信號(hào)較高，同時(shí)用Poroshell 120 EC-C18 色譜柱分離效果最好，但6種物質(zhì)仍不能完全分離；向水相中加入0.1%甲酸后，分離效果變好，且以乙腈為有機(jī)相，進(jìn)行等度洗脫，6種目標(biāo)物可實(shí)現(xiàn)完全分離（見圖1）。

圖1 6 種分析物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of a mixed standard solution of 6 analytes

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

對(duì)羥基苯甲酸酯的提取劑多采用乙腈、乙醚，而采用乙酸乙酯的較少。本試驗(yàn)同時(shí)選用乙腈、乙醚和乙酸乙酯為提取劑分別進(jìn)行加標(biāo)提取比較。試驗(yàn)得到6 種分析物在以乙腈為提取劑時(shí)的回收率38.0 %～89.8%；以乙醚為提取劑時(shí)的回收率為8.5%～55.7%；以乙酸乙酯為提取時(shí)的回收率分別為59.3%～116.2%。結(jié)果顯示乙酸乙酯的提取效率最好，所以選擇提取效率較好的乙酸乙酯為提取劑。

為了進(jìn)一步提高6 種化合物的回收率，考慮到對(duì)羥基苯甲酸酯的結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，易電離，因此嘗試了向試樣中加入酸化劑進(jìn)行酸化處理。由于鹽酸具有強(qiáng)酸性、甲酸銨呈弱酸性并具有一定的緩沖能力，所以選用了0.03 mol/L 鹽酸和2 mol/L 甲酸銨進(jìn)行酸化處理，按照“1.3”前處理方法進(jìn)行試驗(yàn)。6 種目標(biāo)物在以鹽酸和甲酸銨為酸化劑時(shí)的回收率分別為29.1%～88.1%、75.9%～96.2%，在以甲酸銨為酸化劑進(jìn)行酸化處理時(shí)整體回收率較高，最終選用2 mol/L 甲酸銨進(jìn)行酸化。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）是指基質(zhì)成分和目標(biāo)分析物以外的其他成分對(duì)待測(cè)物測(cè)定值的影響，使用ESI 模式檢測(cè)時(shí)，基質(zhì)主要影響目標(biāo)化合物的離子化，使其響應(yīng)信號(hào)增強(qiáng)或減弱，從而形成基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng)[17-18]。試驗(yàn)采用同一質(zhì)量濃度待測(cè)物在基質(zhì)液與溶劑中峰面積的比值評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)[19]，比值越接近1，則基質(zhì)效應(yīng)越小。比值為80%～120%時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)較小，可忽略[20]；比值低于80%或高于120%時(shí)，表明有較強(qiáng)的基質(zhì)抑制或增強(qiáng)作用，需用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正。將不含目標(biāo)物的樣品按“1.3”方法進(jìn)行提取得到基質(zhì)溶液，比較了質(zhì)量濃度為10、50、100 μg/L時(shí)酒的基質(zhì)效應(yīng)，得到ME 為35.6%～66.8%，表明有較強(qiáng)基質(zhì)抑制效應(yīng)，因此采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量分析。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性范圍、檢出限和定量限

用空白基質(zhì)提取液配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為 5、10、20、50 、100、200、500、1 000、2 000 μg/L。以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（X，μg/L）為橫坐標(biāo)，分析物峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得到相應(yīng)的線性方程。以空白樣品為基質(zhì)，在測(cè)定11 個(gè)空白樣品的基礎(chǔ)上，分別計(jì)算得到每種對(duì)羥基苯甲酸酯的檢出限（limit of detection，LOD，S/N=3）與定量限（limits of quantitation，LOQ，S/N=10）[21-22]。6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的線性關(guān)系、檢出限和定量限見表2。

表2 6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 2 Linear relationship，LOD and LOQ of 6 PBs

由表2可知，6 種對(duì)羥基苯甲酸酯在5 μg/L～2 000 μg/L 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)都可達(dá)到 0.999 以上，方法檢出限為 0.8 μg/kg～1.1 μg/kg，定量限為 2.9 μg/kg～3.6 μg/kg。

2.5.2 方法準(zhǔn)確度與精密度

取酒空白樣品，分別按 5、100、1 000 μg/kg 3 個(gè)水平濃度進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平濃度平行測(cè)定7次，通過計(jì)算得出每種對(duì)羥基苯甲酸酯的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的平均回收率為76.1 %～108.5 %，RSD 為1.1%～9.1%。表明本方法準(zhǔn)確度高，精密度好，能夠滿足酒中6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的檢測(cè)要求，如表3所示。

表3 酒中6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=7）Table 3 Spiked recovery and RSD of 6 PBs in wine（n=7）

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用本方法對(duì)購自石家莊市不同超市的30 份酒樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中包括白酒、紅酒、黃酒、啤酒、果酒、米酒各5 份。所測(cè)樣品中，白酒、啤酒和米酒樣品未檢出對(duì)羥基苯甲酸酯，果酒、紅酒、黃酒樣品全部檢出對(duì)羥基苯甲酸乙酯，在果酒中含量為5.5 μg/kg ～13.8 μg/kg；紅酒中含量為 6.4 μg/kg ～8.2 μg/kg，黃酒中含量為 5.7 μg/kg ～34.6 μg/kg。此外，在一份黃酒中同時(shí)檢出了對(duì)羥基苯甲酸異丙酯，含量為1.2 μg/kg。參照GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》關(guān)于對(duì)羥基苯甲酸酯類及其鈉鹽在調(diào)味制品和飲料類制品中的限量標(biāo)準(zhǔn)，所測(cè)樣品檢出值均小于國家限量標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用乙酸乙酯為溶劑超聲輔助提取，建立了HPLC-MS/MS 同時(shí)測(cè)定酒中6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，6 種對(duì)羥基苯甲酸酯在5 μg/L～2 000 μg/L 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為 0.8 μg/kg～1.0 μg/kg、定量限為 3.1 μg/kg～3.6 μg/kg，該方法前處理操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、精密度好、準(zhǔn)確度高，適用于酒中6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的定性定量分析。