趙靈芝,黃笑晨,花中霞,秦江芬,楊莉麗,王可,,
(1.河北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,河北 石家莊 050024;2.石家莊市疾病預(yù)防控制中心,河北 石家莊 050011)
作為一類常用的防腐劑,對(duì)羥基苯甲酸酯(p arabens,PBs)又稱尼鉑金酯[1],主要包括對(duì)羥基苯甲酸甲酯(methylparaben,MHB)、對(duì)羥基苯甲酸乙酯(ethylparaben,EHB)、對(duì)羥基苯甲酸丙酯(propylparaben,PHB)、對(duì)羥基苯甲酸異丙酯(isoppylparaben,IPHB)、對(duì)羥基苯甲酸丁酯(butylparaben,BHB)、對(duì)羥基苯甲酸異丁酯(isobutylparaben,IBHB)[2]。與其它類的防腐劑相比較,對(duì)羥基苯甲酸酯因具有低毒安全、強(qiáng)殺菌和防腐能力、在較寬的pH 值范圍內(nèi)有良好的抗菌性能[3],而被廣泛應(yīng)用于食品[4-5]、藥品[6-7]、化妝品及個(gè)人護(hù)理品[8]。盡管如此,研究發(fā)現(xiàn)對(duì)羥基苯甲酸酯具有一定的雌激素活性和生殖毒性,能夠影響內(nèi)源性雌激素的代謝,導(dǎo)致線粒體功能障礙[9-10];且相關(guān)研究表明其具有一定的內(nèi)分泌干擾效應(yīng),并與男性不育及乳腺癌的發(fā)生存在一定關(guān)系[11]。目前,我國GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定了十余種食品中對(duì)羥基苯甲酸酯的最大使用限量(以對(duì)羥基苯甲酸計(jì))不超過0.25 g/kg,經(jīng)表面處理過的新鮮水果及蔬菜不超過0.012 g/kg。
迄今為止,食品中對(duì)羥基苯甲酸酯的檢測(cè)方法主要包括氣相色譜法(gas chromatography,GC)[12-13]、膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳色譜法(micellar electrokinetic capillary electrophoresis chromatography,MECC)[14]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[15]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[16]等。其中,相比于其它幾種檢測(cè)方法,LC-MS/MS法具有靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確、可實(shí)現(xiàn)多種物質(zhì)痕量測(cè)定等優(yōu)點(diǎn),在多分析物檢測(cè)方面應(yīng)用廣泛。目前,國內(nèi)外文獻(xiàn)關(guān)于食品中對(duì)羥基苯甲酸酯的檢測(cè)多為其中的對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯,且檢測(cè)對(duì)象主要包括了調(diào)味品、醬腌菜、即食食品、鮮水果及果蔬汁,而關(guān)于酒中6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的檢測(cè)研究還未見報(bào)道。因此,本試驗(yàn)通過對(duì)前處理方法、色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化,建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS) 同時(shí)測(cè)定酒中6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的檢測(cè)方法,旨在為開展酒中防腐劑的檢測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,加強(qiáng)質(zhì)量監(jiān)管提供技術(shù)支撐。
1.1.1 材料與試劑
MHB、IPHB、PHB(純度均大于 98.0 %):德國 Dr.Ehrenstorfer 公司;IBHB(純度 99.0%):日本東京化學(xué)試劑公司;BHB(純度99.0%):天津科密歐化學(xué)有限公司;EHB(純度大于99.0%):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈、甲醇(色譜純):美國Fisher 公司;甲酸、甲酸銨(色譜純):美國Dikma 公司;試驗(yàn)用水為Milli-Q 超純水。所測(cè)白酒、紅酒、啤酒、黃酒、果酒和米酒樣品購于石家莊市區(qū)超市。
1.1.2 儀器與設(shè)備
Agilent 1200-6410B 高效液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有ESI 離子源):美國Agilent 科技有限公司;Mettler-Toledo AE240 電子天平:瑞士梅特勒-托利多公司;C3I 型臺(tái)式離心機(jī):法國Jouan 公司;MS3 渦旋振蕩器:德國 IKA 公司;N-EVAP-111 氮吹儀:美國Organomation 公司;Milli-Q 超純水機(jī):美國Millipore公司。
1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
分別準(zhǔn)確稱取適量 MHB、EHB、PHB、IPHB、BHB和IBHB 6 種標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈溶解配制1 g/L 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,保存于-20 ℃冰箱備用。取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用含有25%乙腈的水溶液稀釋,得到1 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)液。采用空白基質(zhì)提取液稀釋,配制 5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 μg/L 系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
1.2.2 樣品前處理
準(zhǔn)確稱取2.0 g(精確至0.01 g)樣品于50.0 mL 離心管中,分別加入1.0 mL 2 mol/L 甲酸銨和10.0 mL 乙酸乙酯,渦旋30 s,超聲提取5 min,然后加入0.5 g 氯化鈉,渦旋混勻,以8 000 r/min 離心5 min。移取乙酸乙酯層,再加入10.0 mL 乙酸乙酯進(jìn)行二次提取,合并兩次提取液并用乙酸乙酯定容至20.0 mL,取2.0 mL 提取液在 45 ℃下氮?dú)獯蹈伞S?1.0 mL 乙腈-水(25 ∶75,體積比)溶解,過 0.2 μm 濾膜,待 HPLC-MS/MS 分析。
1.3.1 色譜條件
色譜柱:Poroshell 120 EC-C18(2.1 mm×75 mm,2.7 μm);流速:0.4 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:5 μL;流動(dòng)相:乙腈 -0.1%甲酸(體積分?jǐn)?shù))水溶液(25 ∶75,體積比);等度洗脫。
1.3.2 質(zhì)譜條件
離子源:電噴霧離子源(electrospray ionization source,ESI),負(fù)離子掃描模式;干燥氣:氮?dú)?;干燥氣溫度?50 ℃;干燥氣流速:10 L/min;毛細(xì)管電壓:4 000 v;霧化氣壓力:103.4 kPa;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)
對(duì)羥基苯甲酸酯的結(jié)構(gòu)中含有酚羥基,容易失去H+,以[M-H]-形式存在。因此,選擇ESI 負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。通過全掃描模式得出其母離子[M-H]-,6 種分析物先后通過選擇性離子掃描模式得到相對(duì)應(yīng)的碎裂電壓,然后通過子離子掃描模式獲得定性離子對(duì),同時(shí)優(yōu)化碰撞能。以豐度較大的兩個(gè)碎片離子作為各對(duì)羥基苯甲酸酯的定性離子,其中相對(duì)豐度最大的子離子作為定量離子。6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的質(zhì)譜參數(shù)見表1。
表1 6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of 6 PBs
本試驗(yàn)分別以甲醇-水和乙腈-水為流動(dòng)相,先后嘗試了 XDB-C18,Eclipse plus C18,WCX-1,Poroshell 120 Hilic 及Poroshell 120 EC-C18 5 款色譜柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn),有機(jī)相為乙腈時(shí),6 種化合物的響應(yīng)信號(hào)較高,同時(shí)用Poroshell 120 EC-C18 色譜柱分離效果最好,但6種物質(zhì)仍不能完全分離;向水相中加入0.1%甲酸后,分離效果變好,且以乙腈為有機(jī)相,進(jìn)行等度洗脫,6種目標(biāo)物可實(shí)現(xiàn)完全分離(見圖1)。
圖1 6 種分析物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of a mixed standard solution of 6 analytes
對(duì)羥基苯甲酸酯的提取劑多采用乙腈、乙醚,而采用乙酸乙酯的較少。本試驗(yàn)同時(shí)選用乙腈、乙醚和乙酸乙酯為提取劑分別進(jìn)行加標(biāo)提取比較。試驗(yàn)得到6 種分析物在以乙腈為提取劑時(shí)的回收率38.0 %~89.8%;以乙醚為提取劑時(shí)的回收率為8.5%~55.7%;以乙酸乙酯為提取時(shí)的回收率分別為59.3%~116.2%。結(jié)果顯示乙酸乙酯的提取效率最好,所以選擇提取效率較好的乙酸乙酯為提取劑。
為了進(jìn)一步提高6 種化合物的回收率,考慮到對(duì)羥基苯甲酸酯的結(jié)構(gòu)中含有酚羥基,易電離,因此嘗試了向試樣中加入酸化劑進(jìn)行酸化處理。由于鹽酸具有強(qiáng)酸性、甲酸銨呈弱酸性并具有一定的緩沖能力,所以選用了0.03 mol/L 鹽酸和2 mol/L 甲酸銨進(jìn)行酸化處理,按照“1.3”前處理方法進(jìn)行試驗(yàn)。6 種目標(biāo)物在以鹽酸和甲酸銨為酸化劑時(shí)的回收率分別為29.1%~88.1%、75.9%~96.2%,在以甲酸銨為酸化劑進(jìn)行酸化處理時(shí)整體回收率較高,最終選用2 mol/L 甲酸銨進(jìn)行酸化。
基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,ME)是指基質(zhì)成分和目標(biāo)分析物以外的其他成分對(duì)待測(cè)物測(cè)定值的影響,使用ESI 模式檢測(cè)時(shí),基質(zhì)主要影響目標(biāo)化合物的離子化,使其響應(yīng)信號(hào)增強(qiáng)或減弱,從而形成基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng)[17-18]。試驗(yàn)采用同一質(zhì)量濃度待測(cè)物在基質(zhì)液與溶劑中峰面積的比值評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)[19],比值越接近1,則基質(zhì)效應(yīng)越小。比值為80%~120%時(shí),表明基質(zhì)效應(yīng)較小,可忽略[20];比值低于80%或高于120%時(shí),表明有較強(qiáng)的基質(zhì)抑制或增強(qiáng)作用,需用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正。將不含目標(biāo)物的樣品按“1.3”方法進(jìn)行提取得到基質(zhì)溶液,比較了質(zhì)量濃度為10、50、100 μg/L時(shí)酒的基質(zhì)效應(yīng),得到ME 為35.6%~66.8%,表明有較強(qiáng)基質(zhì)抑制效應(yīng),因此采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量分析。
2.5.1 線性范圍、檢出限和定量限
用空白基質(zhì)提取液配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度分別為 5、10、20、50 、100、200、500、1 000、2 000 μg/L。以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(X,μg/L)為橫坐標(biāo),分析物峰面積(Y)為縱坐標(biāo),得到相應(yīng)的線性方程。以空白樣品為基質(zhì),在測(cè)定11 個(gè)空白樣品的基礎(chǔ)上,分別計(jì)算得到每種對(duì)羥基苯甲酸酯的檢出限(limit of detection,LOD,S/N=3)與定量限(limits of quantitation,LOQ,S/N=10)[21-22]。6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的線性關(guān)系、檢出限和定量限見表2。
表2 6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 2 Linear relationship,LOD and LOQ of 6 PBs
由表2可知,6 種對(duì)羥基苯甲酸酯在5 μg/L~2 000 μg/L 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)都可達(dá)到 0.999 以上,方法檢出限為 0.8 μg/kg~1.1 μg/kg,定量限為 2.9 μg/kg~3.6 μg/kg。
2.5.2 方法準(zhǔn)確度與精密度
取酒空白樣品,分別按 5、100、1 000 μg/kg 3 個(gè)水平濃度進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)水平濃度平行測(cè)定7次,通過計(jì)算得出每種對(duì)羥基苯甲酸酯的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的平均回收率為76.1 %~108.5 %,RSD 為1.1%~9.1%。表明本方法準(zhǔn)確度高,精密度好,能夠滿足酒中6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的檢測(cè)要求,如表3所示。
表3 酒中6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=7)Table 3 Spiked recovery and RSD of 6 PBs in wine(n=7)
利用本方法對(duì)購自石家莊市不同超市的30 份酒樣品進(jìn)行檢測(cè),其中包括白酒、紅酒、黃酒、啤酒、果酒、米酒各5 份。所測(cè)樣品中,白酒、啤酒和米酒樣品未檢出對(duì)羥基苯甲酸酯,果酒、紅酒、黃酒樣品全部檢出對(duì)羥基苯甲酸乙酯,在果酒中含量為5.5 μg/kg ~13.8 μg/kg;紅酒中含量為 6.4 μg/kg ~8.2 μg/kg,黃酒中含量為 5.7 μg/kg ~34.6 μg/kg。此外,在一份黃酒中同時(shí)檢出了對(duì)羥基苯甲酸異丙酯,含量為1.2 μg/kg。參照GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》關(guān)于對(duì)羥基苯甲酸酯類及其鈉鹽在調(diào)味制品和飲料類制品中的限量標(biāo)準(zhǔn),所測(cè)樣品檢出值均小于國家限量標(biāo)準(zhǔn)。
本試驗(yàn)采用乙酸乙酯為溶劑超聲輔助提取,建立了HPLC-MS/MS 同時(shí)測(cè)定酒中6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的方法。試驗(yàn)結(jié)果表明,6 種對(duì)羥基苯甲酸酯在5 μg/L~2 000 μg/L 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,檢出限為 0.8 μg/kg~1.0 μg/kg、定量限為 3.1 μg/kg~3.6 μg/kg,該方法前處理操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、精密度好、準(zhǔn)確度高,適用于酒中6 種對(duì)羥基苯甲酸酯的定性定量分析。