刺梨多酚氧化酶的提取工藝及其抑制劑研究

俞露，穆波，吉升陽

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

刺梨（Rosa roxburghii Tratt）是薔薇科薔薇屬落葉灌木，又名繅絲花、文先果、送春歸，原產(chǎn)云貴高原[1]。刺梨是富含多種營養(yǎng)元素和高物質(zhì)能量的植物，具有很高的醫(yī)學(xué)價(jià)值，在抗衰老、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、對(duì)鉛等有害金屬排解作用、增加機(jī)體免疫力等方面都有很大的功效，在食藥開發(fā)方向具有廣闊前景[2]。目前對(duì)刺梨果實(shí)的研究仍主要集中在食藥價(jià)值、產(chǎn)品開發(fā)及活性成分提取上，對(duì)鮮果貯藏保鮮的研究較少[3]。刺梨在加工貯藏過程中極易發(fā)生褐變，其產(chǎn)生的深色物質(zhì)對(duì)果實(shí)的外觀顏色、風(fēng)味及其營養(yǎng)價(jià)值有極大影響，嚴(yán)重影響果實(shí)的商品價(jià)值，因此，探索如何防止果實(shí)的褐變至關(guān)重要。盡管國內(nèi)外對(duì)鮮切果蔬褐變抑制的研究和報(bào)道很多，但有關(guān)刺梨酶促褐變方面的研究卻未見報(bào)道。

多酚氧化酶 （polyphenol oxidase，PPO）是酶促褐變的關(guān)鍵酶，與果蔬加工制品的色澤、抗氧化能力密切相關(guān)[4]。本文通過研究刺梨中多酚氧化酶的活性，在確定最適提取工藝的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究抗壞血酸、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、檸檬酸等抑制劑對(duì)刺梨PPO酶促反應(yīng)的影響，以期為刺梨的加工與貯藏等過程中防止酶促褐變提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

貴龍5 號(hào)刺梨鮮果：貴州省龍里縣。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

SynergyH 酶標(biāo)儀：美國 BioTeK 公司；H1-16KR型高速冷凍離心機(jī)：湖南可成儀器設(shè)備有限公司；HH-6電熱恒溫水浴鍋：金壇區(qū)西城新瑞儀器廠；奧豪斯ohaus ST3100pH 計(jì)：北京中創(chuàng)先鋒科技有限公司；Eppendorf 移液槍：上海麥尚科學(xué)儀器公司；FA2004 精密天平：天津天馬衡基儀器有限公司；DW-HL398S 超低溫冷凍儲(chǔ)存冰箱：上海始恒儀器設(shè)備有限公司。

1.2.2 主要試劑

磷酸氫二鈉：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；一水合檸檬酸、抗壞血酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、鄰苯二酚：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。試劑均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 PPO 粗酶液的提取

將10 g 刺梨鮮果搗碎混勻后，準(zhǔn)確稱取0.3 g 混勻樣品，于提前預(yù)冷的研缽內(nèi)，加入3 mL 預(yù)冷的0.1 mol/L的磷酸氫二鈉-檸檬酸的緩沖液，并加入0.8 g PVP，在冰水浴中研磨2 min 至勻漿，然后將勻漿全部轉(zhuǎn)入離心管，放入冷凍離心機(jī)中，在4 ℃、12 000 r/min 件下離心30 min，收集上清液即為刺梨PPO 粗酶液，于4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆肹5-6]。

1.3.2 多酚氧化酶酶活力測定

以鄰苯二酚為底物，加入緩沖液和酶液后，用Biotek SynergyH 酶標(biāo)儀檢測反應(yīng)液在410 nm 處的吸光度值（A 值），依據(jù)曲線最初的直線部分計(jì)算酶活力[7-9]。以在1 min 內(nèi)引起吸光度變化0.01 為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 底物濃度對(duì)PPO 活性的影響

取2 mL 濃度為0.1 mol/L 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 6.0）于5 mL 離心管中，分別加入0.25 mL PPO 粗酶提取液及 1 mL 濃度分別為 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mol/L 的鄰苯二酚溶液，30 ℃恒溫水浴1 min 后，立即將離心管轉(zhuǎn)入90 ℃沸水中終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在410 nm 下測定其吸光度值。

1.3.3.2 反應(yīng)溫度對(duì)PPO 活性測定的影響

取2 mL 濃度為0.1 mol/L 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 6.0）于 5 mL 離心管中，分別加入 1.0 mL 濃度為0.12 mol/L 鄰苯二酚溶液及0.25 mL PPO 粗酶提取液，不同溫度（20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃）恒溫水浴1 min 后，立即將離心管轉(zhuǎn)入90 ℃沸水中終止反應(yīng)[10]，用酶標(biāo)儀在410 nm 下測定其吸光度值。

1.3.3.3 緩沖液pH 值對(duì)PPO 活性的影響

取2 mL 不同pH 值的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（0.1 mol/L）于5 mL 離心管中，分別加入1.0 mL 濃度為0.12 mol/L 鄰苯二酚溶液及0.25 mL PPO 粗酶提取液，30 ℃恒溫水浴1 min 后，立即將離心管轉(zhuǎn)入90 ℃沸水中終止反應(yīng)[11]，用酶標(biāo)儀在410 nm 下測定其吸光度值。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以緩沖液pH 值、底物濃度、反應(yīng)溫度為考察因素，見表1，以刺梨PPO 活性為指標(biāo)，選用正交表對(duì)刺梨PPO 測定工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，探尋測定刺梨PPO 活性的最佳條件。

表1 正交試驗(yàn)因子及水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal experiment

1.3.5 抑制劑對(duì)刺梨PPO 活性的影響

酶是蛋白質(zhì)的一種，根據(jù)抑制劑與酶的作用方式以及抑制的是否可逆，將抑制作用分為不可逆抑制和可逆抑制[11]。常用的可逆抑制劑有檸檬酸、抗壞血酸、蘋果酸及其它有機(jī)酸混合溶液[12-13]，不可逆抑制劑有半胱氨酸、EDTA-2Na 等[14]。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[15]，本文選取檸檬酸、抗壞血酸、EDTA-2Na 作為刺梨PPO 的酶活抑制劑。

分別取 0.5 mL 配制的濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的抗壞血酸、EDTA-2Na、檸檬酸溶液于5 mL離心管中，加入2 mL 濃度為0.1 mol/L 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 6.0），然后往每個(gè)離心管中分別加入1.0 mL 濃度為0.12 mol/L 的鄰苯二酚溶液及0.25 mL PPO 粗酶液，30 ℃恒溫水浴1 min 后，立即將離心管轉(zhuǎn)入90 ℃沸水中終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在410 nm 下測定其吸光度值，考察3 種不同抑制劑對(duì)刺梨PPO 活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 緩沖液pH值對(duì)PPO活性的影響

緩沖液pH 值對(duì)PPO 活性的影響見圖1。

圖1 緩沖液pH 值對(duì)PPO 活性的影響Fig.1 Effect of the buffer pH value on PPO activity

文獻(xiàn)報(bào)道，不同果蔬品種最適pH 值也不同，碭山酥梨 PPO 的最適 pH 值為 4.5[16]，甘薯 PPO 最適 pH 值為4.4[17]，無核白葡萄PPO 最適pH 值為5.7[18]。由圖1可知，刺梨PPO 活性對(duì)緩沖液pH 值的變化較為敏感，其活性隨緩沖液pH 值的變化總體呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)pH 值從4.0 增加到6.0 時(shí)，PPO 活性呈明顯上升趨勢，且pH 4.0 的PPO 相對(duì)活性僅是pH 6.0 時(shí)的21.92%；隨后，當(dāng)pH 值從6.0 增加到8.0 時(shí)，PPO活性呈逐漸下降趨勢?？梢钥闯?，測定該刺梨PPO 活性的最適pH 值為6.0。

2.2 底物濃度對(duì)PPO活性的影響

底物濃度對(duì)PPO 活性的影響見圖2。

圖2 底物濃度對(duì)PPO 活性的影響Fig.2 Effect of the substrate concentration on PPO activity

由圖2可知，當(dāng)?shù)孜餄舛揉彵蕉訚舛刃∮?.12 mol/L 時(shí)，PPO 活性隨底物濃度的增加而顯著增強(qiáng)，酶活力與底物濃度之間近似呈線性關(guān)系，且底物濃度為0.02 mol/L 時(shí)PPO 活性僅是濃度為0.12 mol/L時(shí)PPO 活性的33.8%。當(dāng)?shù)孜餄舛葷舛却笥?.12 mol/L時(shí)，PPO 酶活性逐漸開始緩慢下降，因此，測定該刺梨PPO 活性的最適底物濃度為0.12 mol/L。

2.3 反應(yīng)溫度對(duì)PPO活性的影響

反應(yīng)溫度對(duì)PPO 活性的影響見圖3。

圖3 溫度對(duì)PPO 活性的影響Fig.3 Effect of the temperature on PPO activity

不同物種的PPO 酶促反應(yīng)的最適溫度也不相同，李桂琴等[19]在以鄰苯二酚為底物時(shí)研究發(fā)現(xiàn)鴨梨果肉中多酚氧化酶的最適提取溫度是25 ℃；Gisela 等[20]報(bào)道曼密蘋果的多酚氧化酶最適提取溫度為35 ℃，Waliszewski K N 等[21]研究發(fā)現(xiàn)香草豆中的PPO 最適反應(yīng)溫度是37 ℃。由圖3可知，溫度對(duì)刺梨鮮果PPO 活性有顯著影響，從整個(gè)曲線來看，當(dāng)溫度在20 ℃～35 ℃時(shí)，PPO 活性呈明顯上升趨勢，且35 ℃時(shí)活性最高。但當(dāng)溫度大于35 ℃以上時(shí)，PPO 活性開始迅速下降，當(dāng)溫度升高到60 ℃時(shí)，PPO 基本失活。因此，測定該刺梨PPO 活性的最適溫度為35 ℃。

2.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以刺梨PPO 活性為考核指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，各試驗(yàn)組合測定3 次，取其平均值，對(duì)刺梨PPO 提取工藝條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，其試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 Analysis of orthogonal test results

由表2可知，經(jīng)過極差比較分析可知，極差值R越大，說明該因素對(duì)刺梨PPO 提取工藝的影響越大，各因素對(duì)刺梨PPO 提取工藝條件影響作用的主次關(guān)系為A>C>B，即緩沖液pH 值>溫度>底物濃度。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平范圍內(nèi)，優(yōu)化得到刺梨PPO 提取工藝最佳條件為A2B2C2即刺梨PPO 提取工藝最佳條件緩沖液pH 值為6.0、溫度為30 ℃、底物濃度為0.12 mol/L。

2.5 方差分析

方差分析見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3方差分析結(jié)果顯示，緩沖液pH 值（A）、底物濃度（B）無顯著性差異（P＞0.05），溫度（C）有顯著性差異（P＜0.05）。R2=0.989，R2adj=0.955.

為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)的可靠性，采用得到的最佳提取工藝條件進(jìn)行刺梨PPO 提取的驗(yàn)證試驗(yàn)。以緩沖液pH 值為6.0，提取溫度為30 ℃，底物濃度為0.12 mol/L 為最佳。3 次平行試驗(yàn)得到的PPO 平均活性為342.67 U/（g·min）與理論值相差2.34 U/（g·min）。因此通過正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的刺梨PPO 提取工藝條件是可行的。

2.6 抑制劑對(duì)刺梨PPO活性的影響

抑制劑對(duì)刺梨PPO 活性的影響見圖4。

圖4 常用抑制劑對(duì)刺梨PPO 酶活力的影響Fig.4 Effect of the different inhibitors on PPO activity

由圖4可以看出，刺梨PPO 活性均隨各抑制劑濃度的增大而減少，說明抗壞血酸、EDTA-2Na 及檸檬酸對(duì)抑制刺梨PPO 的褐變作用與抑制劑濃度呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。同時(shí)，抑制劑對(duì)刺梨PPO 酶促褐變抑制的強(qiáng)弱順序?yàn)椋嚎箟难幔緳幟仕幔綞DTA-2Na，其中抗壞血酸對(duì)刺梨PPO 酶促褐變的抑制效果最佳。

3 結(jié)論與討論

本文通過正交試驗(yàn)對(duì)刺梨PPO 的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，試驗(yàn)研究表明，對(duì)刺梨中多酚氧化提取的主要影響因素作用的主次關(guān)系為：緩沖液pH 值＞溫度＞底物濃度。刺梨PPO 提取工藝最佳組合條件為A2B2C2即緩沖液pH 為6.0、水浴溫度30 ℃、底物濃度為0.12 mol/L。由于pH 值和溫度對(duì)PPO 活性有較大影響，在實(shí)踐中可以利用調(diào)節(jié)pH 值和高溫（熱燙）鈍化酶活，從而減少褐變的發(fā)生。

試驗(yàn)結(jié)果表明，抗壞血酸、EDTA-2Na 和檸檬酸均能有效抑制刺梨果實(shí)PPO 活性，其中抗壞血酸抑制刺梨PPO 活性的效果最佳，當(dāng)抗壞血酸濃度為1.0 mg/mL時(shí)，刺梨PPO 已基本喪失活性。不同抑制劑抑制機(jī)理不同[22]，檸檬酸中含有的羧基很有可能與多酚氧化酶的酶活性中心部位以外其他親和集團(tuán)如氨基等結(jié)合，再進(jìn)一步與底物結(jié)合形成酶抑制底物復(fù)合物，在酶的作用附近形成了空間位阻，從而阻止酶與底物的結(jié)合，從而降低酶的催化反應(yīng)[23]。EDTA-2Na 與底物競爭性地與多酚氧化酶結(jié)合，并且抑制劑結(jié)合物不與底物發(fā)生催化反應(yīng)，使酶與底物的結(jié)合的濃度下降，從而降低了酶的催化作用[15]。抗壞血酸是近年來食品工業(yè)中應(yīng)用最多的褐變抑制劑，它在酶反應(yīng)體系中的作用是相當(dāng)復(fù)雜的。它既是還原劑可以還原醌類物質(zhì)，而且還可以作為銅離子的螯合劑；通過-OH 與多酚氧化酶的輔基Cu2+螯和，也可以直接被多酚氧化酶氧化，起到競爭性抑制作用。同時(shí)抗壞血酸的添加量十分關(guān)鍵，添加量過少，不僅不能抑制褐變，反而易與氨基酸反應(yīng)促進(jìn)羰氨反應(yīng)造成非酶褐變；添加量過多，成品在貯存期間，特別是在較高溫度下，由于氧化后所形成的酮化合物與氨化合物發(fā)生非酶促褐變反應(yīng)，從而加劇成品的變色[24]。目前，在果蔬防褐處理中，提倡多種抑制劑結(jié)合使用以提高抗褐變效果。因此，在對(duì)刺梨單因素抑制劑研究的基礎(chǔ)上，因此還需在對(duì)刺梨抑制劑單因素研究的基礎(chǔ)上，對(duì)不同抑制劑多種因素協(xié)同作用的抑制效應(yīng)做更加深入的研究。以期更好地提高對(duì)刺梨PPO 活性的抑制效果。