黃曲霉毒素B1降解菌株的篩選及鑒定

金佳佳，吳思敏，鄭思珩，張 娟，嚴(yán)家俊*

（1.廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東 佛山 528300；

2.黃埔海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510730）

黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是目前已發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的一種，其具有強(qiáng)肝毒性、高致突變性和高致畸性[1]，廣泛存在于農(nóng)產(chǎn)品及飼料食品中，對(duì)人類健康存在嚴(yán)重威脅，同時(shí)對(duì)糧食和畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。AFB1的去除方法主要有物理法、化學(xué)法和微生物法。相對(duì)于物理法和化學(xué)法而言，微生物降解法反應(yīng)條件溫和，不易造成營養(yǎng)的流失，也不易產(chǎn)生新的毒素[2-3]。有選擇性的使用微生物降解AFB1是一種對(duì)產(chǎn)品價(jià)值無明顯損壞的去毒方法，因而，尋找能夠高效安全降解AFB1的菌株已成為目前的研究熱點(diǎn)[4-5]。

近年來，國內(nèi)外已對(duì)降解AFB1的微生物進(jìn)行了大量研究。PETCHKONGKAEWA等[6]從泰國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中篩選到一株能降解AFB1的芽孢桿菌（Bacillusspp.）；TENIOLAO等[7]從受多環(huán)芳烴污染的土壤中分離出一株具有降解AFB1的紅串紅球菌（Rhodococcus erythropolis）；張盼等[8]從發(fā)酵食品納豆中篩選出一株AFB1降解率達(dá)到85.73%的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；關(guān)心等[9]從雞糞中分離得到一株對(duì)AFB1高效降解的蔬菜芽孢桿菌（Bacillus oleronius）；朱新貴等[10-12]也利用該種方法篩選得到不同的菌株。

雖然已有大量研究，但是真菌對(duì)AFB1降解率不高，且降解機(jī)理較為復(fù)雜，反應(yīng)時(shí)間較長，因而較難進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用[13-14]。細(xì)菌降解AFB1是一種有效、安全和環(huán)保的解毒方法。因此，本實(shí)驗(yàn)從多種不同環(huán)境中篩選能夠高效、安全降解AFB1的細(xì)菌，并采用形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。一方面為生物法降解AFB1的研究奠定基礎(chǔ)，另一方面通過初步研究，為后期生物法降解AFB1的實(shí)際應(yīng)用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

豆類發(fā)酵食品、不同環(huán)境的土壤、動(dòng)物腸道及其內(nèi)容物：采集于佛山地區(qū)。

1.1.2 主要試劑

香豆素、AFB1標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；真菌抑制劑：美國Biosharp公司；AFB1快速檢測(cè)試劑盒：北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、DNAMarker、DNA膠回收盒：日本Takara公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國默克公司；革蘭氏染色液試劑盒：青島海博生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)快速染色液：北京百奧萊博科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：（NH4）2SO45.0g，NaCl8.5g，超純水1000mL，pH 7.0，121℃滅菌15 min。加入過濾除菌的香豆素溶液至1 g/L。

初篩培養(yǎng)基：（NH4）2SO45.0 g，KH2PO42.5 g，MgSO41.0 g，Na2HPO4·12H2O 0.5 g，CaCl20.1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 6.5，121℃滅菌15 min。加入過濾除菌的香豆素溶液至1 g/L。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10 g，NaCl 5.0 g，pH 7.0，121℃滅菌15 min。固體培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂。

復(fù)篩培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10 g，葡萄糖1.0 g，NaCl8.5g，KH2PO41.0g，蒸餾水1L，pH6.0，121℃滅菌15min。

斜面培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan MK3酶標(biāo)儀：美國Thermo公司；MS3旋渦混合器：德國IKA公司；AG22331聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chainreaction，PCR）儀：德國艾本德公司；DYCZ-24電泳儀：北京六一生物科技有限公司；BX51顯微鏡：日本奧林巴斯公司；GHP-9160隔水式培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CL-40M高壓滅菌鍋：日本ALP公司。

1.3 方法

1.3.1 富集培養(yǎng)

取5 g樣品于含有45 mL生理鹽水的均質(zhì)袋中，利用均質(zhì)器使樣品和生理鹽水混合均勻。從中吸取5mL加入45mL富集培養(yǎng)基中，加入0.1 g真菌抑制劑，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24h，進(jìn)行富集培養(yǎng)，以相同培養(yǎng)條件連續(xù)富集3次。

1.3.2 AFB1降解菌株的篩選

初篩：取富集培養(yǎng)液1mL于含9mL生理鹽水的試管中，渦旋混勻。梯度稀釋至10-4，吸取200 μL稀釋液涂布于初篩培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)7 d。選取生長良好的單菌落保存于斜面培養(yǎng)基。

復(fù)篩：取斜面培養(yǎng)基中的菌株一環(huán)接種于10 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取5 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液于45 mL復(fù)篩培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3d。取培養(yǎng)液800μL，加入200μL質(zhì)量濃度為100μg/L的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，以復(fù)篩培養(yǎng)基加等量AFB1標(biāo)準(zhǔn)品作為空白對(duì)照組。將樣品置于37℃條件下避光靜置培養(yǎng)72h后，4000r/min離心5min，吸取上清液，采用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定AFB1含量。

1.3.3 降解作用與吸附作用的區(qū)分

將1.3.2中與AFB1反應(yīng)后的培養(yǎng)液進(jìn)行離心，去除上清液。加入1.0 mL磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（10 mmol/L，pH 7.0），渦旋混勻。37 ℃靜置10 min，離心，將洗脫液移至5 mL離心管中，重復(fù)洗脫3次。使用體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇進(jìn)行提取，采用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定提取液中AFB1的含量。以含質(zhì)量濃度為20 μg/L AFB1的磷酸鹽緩沖液作為空白對(duì)照。

1.3.4 AFB1降解菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：將篩選菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)24h。采用接種環(huán)在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，37℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)胞形態(tài)。

生理生化鑒定：分別進(jìn)行過氧化氫酶、接觸酶、脲酶、氨基酸脫羧酶與水解酶、糖醇類發(fā)酵、硝酸鹽還原、酸堿耐受性等試驗(yàn)，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[16]進(jìn)行初步鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：采用DNA提取試劑盒提取篩選菌株的基因組DNA，以其為模板，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì)篩選菌株的16SrRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：模板DNA2μL，上下游引物（20μmol/L）各1 μL，PremixTaqDNA聚合酶25 μL，雙蒸水（ddH2O）21 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，54℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA序列，采用MEGA 7的鄰接（neighbour-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1降解菌株的初篩結(jié)果

AFB1是香豆素的衍生物，兩者結(jié)構(gòu)相似。AFB1具有很強(qiáng)的毒性，如果使用AFB1直接進(jìn)行初篩實(shí)驗(yàn)，可能會(huì)危害實(shí)驗(yàn)者的身體健康。LEELS等[17]研究發(fā)現(xiàn)，微生物降解AFB1的過程可能是分解AFB1中的香豆素基團(tuán)，從而導(dǎo)致其毒性、致畸性的降低。

因此，本研究以香豆素代替AFB1為唯一碳源，進(jìn)行初篩，結(jié)果見表1。由表1可知，共有9株細(xì)菌在以香豆素為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長良好，其中2株（FJ4、FJ12）來源于發(fā)酵食品，1株（HS1）來源于花生地土壤、6株（ZC2、YAC2、JF1、YF4、YC2、YC8）來源于動(dòng)物腸道及其內(nèi)容物。

表1 黃曲霉毒素B1降解菌株初篩結(jié)果Table 1 Preliminary screening results of aflatoxin B1degrading strains

2.2 AFB1降解菌的復(fù)篩結(jié)果

對(duì)初篩得到的9株細(xì)菌進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果見圖1。由圖1可知，空白對(duì)照組中，AFB1降解率為2.2%，9株細(xì)菌的AFB1降解率均高于空白對(duì)照組，且8株細(xì)菌的AFB1降解率均＞50%，其中菌株YC2的AFB1降解能力最強(qiáng)，降解率達(dá)到90.7%。因此，選擇菌株YC2進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖1 黃曲霉毒素B1降解菌株復(fù)篩結(jié)果Fig.1 Secondary screening results of aflatoxin B1degrading strains

2.3 降解作用與吸附作用的區(qū)分

微生物去除AFB1主要有兩種作用方式，一種是降解作用，即將AFB1分解轉(zhuǎn)化，形成新的低毒或無毒的產(chǎn)物。另一種是吸附作用。吸附作用是一種可逆的過程，主要是通過菌株細(xì)胞壁吸附黃曲霉毒素，而非共價(jià)結(jié)合，這種作用過程雖能有效降低AFB1，然而隨著時(shí)間的延長，毒素會(huì)重新釋放，是一種可逆的過程，無法對(duì)毒素達(dá)到有效的去除。因此，區(qū)分菌株降解和吸附作用是研究細(xì)菌降解AFB1的關(guān)鍵[18-22]。

菌株YC2的培養(yǎng)液與AFB1反應(yīng)后，進(jìn)行洗脫、萃取，測(cè)定萃取液中AFB1的含量，空白對(duì)照中AFB1的提取率達(dá)到96.3%，而菌株YC2與AFB1反應(yīng)后的萃取液中AFB1提取率只有2.2%。結(jié)果表明，菌株YC2對(duì)AFB1的去除過程主要為降解反應(yīng)，不是吸附作用。

2.4 菌株YC2的鑒定

2.4.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

菌株YC2的菌落和細(xì)胞形態(tài)見圖2。由圖2a可知，菌株YC2在營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落呈圓形、乳白色，邊緣整齊且薄，菌體中央微隆起，呈丘狀。由圖2b可知，細(xì)胞形態(tài)呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性。

圖2 菌株YC2的菌落（a）和細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.2 Colony(a)and cell(b)morphology of strain YC2

2.4.2 菌株的生理生化特征

由表2可知，菌株YC2能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇等；水解淀粉、液化明膠、還原硝酸鹽、檸檬酸鹽、7%NaCl、甲基紅試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)等均呈陽性反應(yīng)；吲哚、硫化氫、苯丙氨酸酶試驗(yàn)等均呈陰性，且不耐受10%NaCl。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[16]，并結(jié)合形態(tài)特征，初步鑒定菌株YC2隸屬于芽胞桿菌屬（Bacillus）。

表2 菌株YC2的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical tests results of strain YC2

2.4.3菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

菌株16SrRNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖3。由圖3可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長度約1 500 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖3 菌株YC2 16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoregram of 16S rRNA PCR amplification products of strain YC2

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)中進(jìn)行Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該菌株與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的同源性最高，達(dá)99%。選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA序列，采用MEGA 7軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。由圖4可知，菌株YC2與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）KCTC 13241聚于一支，親緣關(guān)系最近，因此，鑒定菌株YC2為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖4 基于16S rRNA序列菌株YC2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain YC2 based on 16S rRNA sequences

3 結(jié)論

以香豆素為唯一碳源，從豆類發(fā)酵食品、土壤、動(dòng)物腸道及其內(nèi)容物中篩選到9株具有AFB1降解能力的菌株，通過復(fù)篩，篩選到一株AFB1降解能力最高的菌株YC2，AFB1降解率為90.7%。通過降解作用與吸附作用的區(qū)分，確定該菌株去除AFB1主要為降解作用。通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定菌株YC2為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）。本研究為生物法降解AFB1的研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)，為后期生物法降解AFB1的實(shí)際應(yīng)用提供技術(shù)依據(jù)。