成熟溫度和時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪中生物活性肽的影響

宋雪梅，梁 琪*，張 炎，吳 晗

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；

2.甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

乳蛋白在加工或者胃腸消化過(guò)程中由于酶的作用能夠產(chǎn)生生物活性肽，被認(rèn)為是許多生物活性肽的重要來(lái)源。生物活性肽含有2～20個(gè)氨基酸殘基，以不同排列和組成方式構(gòu)成，具有免疫調(diào)節(jié)、降血壓、抑菌、抗氧化、抗癌等作用[1-4]，可對(duì)多種代謝和生理功能進(jìn)行積極調(diào)節(jié)，從而影響機(jī)體健康[5]。近年來(lái)，隨著消費(fèi)者對(duì)生活質(zhì)量提高的持續(xù)關(guān)注以及功能性食品的開(kāi)發(fā)，生物活性肽成為醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

干酪富含乳蛋白，在加工過(guò)程特別是在成熟過(guò)程中，因自身存在的降解蛋白質(zhì)的纖溶酶、凝乳酶和微生物活動(dòng)所釋放的蛋白酶、肽酶等的作用，產(chǎn)生了具有抗氧化、抑菌和降血壓等功能的多肽。已在Blue、Danablue、Munster、Camembert和Brie等干酪中發(fā)現(xiàn)了水溶性肽和體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇可溶性肽均具有顯著抗氧化作用[6]。在Pecorino Romano干酪水溶性提取物中發(fā)現(xiàn)了抑菌肽[7]。在Cheddar干酪中鑒定出了6條具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）抑制作用的多肽[8]。干酪生物活性肽的形成與蛋白質(zhì)降解密切相關(guān)，而凝塊pH值、鹽含量、成熟條件、發(fā)酵劑等均影響蛋白質(zhì)降解[9]，因此不同干酪的多肽組成和生物活性具有差異[10]。

牦牛乳硬質(zhì)干酪以生活在青藏高原海拔3 000 m以上的牦牛乳為原料，經(jīng)凝乳、發(fā)酵、排乳清等工序后制作而成，成熟期長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。前期研究發(fā)現(xiàn)，提高成熟溫度能夠促進(jìn)牦牛乳硬質(zhì)干酪的蛋白質(zhì)降解，加快干酪成熟[11]，本文擬研究成熟溫度和時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪中生物活性肽的影響，以探究牦牛乳硬質(zhì)干酪生物活性肽的形成規(guī)律，為深入挖掘牦牛乳硬質(zhì)干酪的功能特性提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛乳：采自甘肅省天祝藏族自治縣抓喜秀龍鄉(xiāng)；CHOOZIT型乳酸菌發(fā)酵劑[保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）]：丹麥丹尼斯克公司；精制小牛凝乳酶（酶活力10萬(wàn)U/g）：蘭州生物技術(shù)有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaures）、大腸桿菌（Escherichia coli）：本實(shí)驗(yàn)室保藏；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；牛肉膏（生化試劑）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；蛋白胨（生化試劑）：上海中秦化學(xué)試劑有限公司；瓊脂（生化試劑）：上海山浦化工有限公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）：美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

干酪槽：本實(shí)驗(yàn)室自制；TGL-20高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-5100真空包裝機(jī)：廣東中山市名康包裝機(jī)械廠；723紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；Scientz-10ND真空冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HZQ-X300電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 干酪制作

參考劉興龍等[12]的方法制作干酪。新鮮干酪在5℃、10℃、15℃分別成熟4、5、6個(gè)月后，將不同成熟階段的干酪儲(chǔ)藏在-18℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 干酪水溶性多肽的提取

參考RIZZELLOCG等[7]的方法提取。以料液比1∶3（g∶mL）加入50mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0），150 r/min、40℃恒溫振蕩1h后，4℃、4 200 r/min離心30 min，除去上層脂肪后，濾紙真空過(guò)濾，將濾液pH值調(diào)至4.6，4℃、7 500 r/min離心10 min后，即獲得上清液，上清液通過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾，真空冷凍干燥，-18℃儲(chǔ)藏備用。

1.3.3 干酪水溶性多肽抗氧化活性測(cè)定

參考SUN T等[13]的方法略作改進(jìn)。將2 mL樣液和2 mL 0.125 mmol/L DPPH溶液，充分振搖后，置于暗處室溫反應(yīng)30 min，再在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)得吸光度值A(chǔ)，以等體積無(wú)水乙醇代替DPPH溶液，測(cè)得吸光度值A(chǔ)b，以等體積蒸餾水代替樣品溶液，測(cè)得吸光度值A(chǔ)0，按下列公式計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除率：

1.3.4 干酪水溶性多肽抑菌活性測(cè)定

參照曾維才等[14]的方法略作修改。以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌為抑菌對(duì)象，采用打孔法進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。將一定濃度的菌懸液按照1∶10（V/V）倒入培養(yǎng)基混合均勻后倒平板，并打孔形成直徑8 mm孔洞，將一定濃度干酪水溶性多肽0.1mL注入孔內(nèi)，生理鹽水作空白對(duì)照，37℃培養(yǎng)24 h后，觀察抑菌效果，每組重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5 干酪水溶性多肽ACE抑制活性測(cè)定

參考楊銘等[15]的方法測(cè)定。樣品組（A）加入200μLHHL和100μLACE抑制劑；對(duì)照組（B）加入200μLHHL；空白組（C）加入250 μL、1 mol/L HCl和200 μL HHL，37 ℃水浴中加熱3 min，同一溫度條件下均加入20 μLACE反應(yīng)30 min；再在A組加入250 μL HCl終止反應(yīng)；B組加入250 μL HCl和100℃硼酸鈉緩沖液；C組加入100 μL硼酸鈉緩沖液。每組試劑在5 mL離心管中混勻，反應(yīng)結(jié)束后加入1.7 mL乙酸乙酯，振蕩、混勻后，4℃、4000r/min離心15min，吸取1.0mL乙酸乙酯于試管中，120℃烘干30min，加入3mL去離子水，在波長(zhǎng)228 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)。按下列公式計(jì)算樣品對(duì)ACE的抑制率：

式中：A

A

為樣品組吸光度值；A

B

為對(duì)照組吸光度值；A

C

為空白組吸光度值。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，如果方差分析差異顯著，用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 成熟條件對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽抗氧化性的影響

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，能接受抗氧化劑提供的電子或質(zhì)子形成穩(wěn)定化合物[16]，因此，本試驗(yàn)以清除DPPH自由基的能力來(lái)衡量干酪水溶性多肽的抗氧化活性。不同溫度及成熟時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪DPPH自由基清除率的影響結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，成熟溫度≤10℃之前、成熟時(shí)間在4～5個(gè)月時(shí)，干酪水溶性多肽對(duì)DPPH自由基清除率呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，成熟時(shí)間在5～6個(gè)月時(shí)，其水溶性多肽對(duì)DPPH自由基清除率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，且成熟5、6個(gè)月干酪的水溶性多肽的抗氧化性之間存在顯著性差異（P＜0.05）。成熟溫度為15℃時(shí)，干酪水溶性多肽抗氧化作用呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，且成熟5、6個(gè)月干酪的水溶性多肽抗氧化作用沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。GUPTA A等[17]對(duì)不同成熟階段Cheddar干酪抗氧化性研究發(fā)現(xiàn)，成熟4個(gè)月之前，干酪抗氧化作用增強(qiáng)，4個(gè)月后，干酪抗氧化性降低，在7～9個(gè)月期間，保持不變。4℃儲(chǔ)藏20d和25℃儲(chǔ)藏5 d的Himalayan干酪的水溶性多肽的抗氧化性增強(qiáng)，而-18℃儲(chǔ)藏20 d的干酪抗氧化性不受影響[18]。方差分析顯示，成熟溫度、時(shí)間及兩者交互作用對(duì)干酪水溶性多肽抗氧化作用影響極顯著（P＜0.01）。

表1 成熟溫度和時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽DPPH自由基清除率的影響Table 1 Effect of ripening temperature and time on DPPH radical scavenging rate of water-soluble peptides in hard cheese made by yak milk

2.2 成熟條件對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽抑制大腸桿菌的影響

不同成熟溫度及時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽抑制大腸桿菌的作用結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可知，在4～6個(gè)月成熟過(guò)程中，5℃、10℃、15℃成熟干酪的水溶性多肽對(duì)大腸桿菌的抑制程度分別呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)，且5℃、10℃、15℃成熟6個(gè)月干酪的水溶性多肽分別比相同溫度成熟4個(gè)月干酪對(duì)大腸桿菌的抑制作用顯著提高15.43%、12.44%和8.32%（P＜0.05）。

圖1 成熟溫度和時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽抑制大腸桿菌的影響Fig.1 Effect of ripening temperature and time on antimicrobial activity of soluble peptides of hard cheese made by yak milk against Escherichia coli

成熟溫度從5℃提高至15℃時(shí)，干酪水溶性多肽對(duì)大腸桿菌的抑菌作用也呈顯著增加趨勢(shì)（P＜0.05）。15℃成熟4個(gè)月干酪的水溶性多肽比5℃相同成熟時(shí)間干酪的水溶性多肽對(duì)大腸桿菌的抑制程度顯著提高13.48%（P＜0.05），15℃成熟6個(gè)月干酪的水溶性多肽對(duì)大腸桿菌的抑制程度比5℃相同成熟時(shí)間干酪的水溶性多肽顯著提高6.49%（P＜0.05）。方差分析顯示，成熟溫度、時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽抑制大腸桿菌的效果影響顯著（P＜0.05）。FIALHO T L等[19]發(fā)現(xiàn)源自卡納斯特拉的手工干酪的水溶多肽也能抑制大腸桿菌。

2.3 成熟條件對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽抑制金黃色葡萄球菌的影響

從圖2可知，5℃、10℃、15℃成熟的牦牛乳硬質(zhì)干酪的水溶性多肽均對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制作用，在4～6個(gè)月成熟過(guò)程中，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制程度分別呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)。5℃成熟5個(gè)月與成熟4個(gè)月、6個(gè)月干酪的水溶性多肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用之間沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），5℃成熟6個(gè)月比相同溫度成熟4個(gè)月干酪的水溶性多肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用顯著高13.55%（P＜0.05）。10℃、15℃成熟6個(gè)月比相同溫度成熟4個(gè)月干酪的水溶性多肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用分別顯著提高16.36%和12.02%（P＜0.05）。

圖2 成熟溫度和時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽抑制金黃色葡萄球菌的影響Fig.2 Effect of ripening temperature and time on antimicrobial activity of soluble peptides of hard cheese made by yak milk againstStaphylococcus aureus

成熟溫度從5℃提高至15℃時(shí)，干酪水溶性多肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用也呈增加趨勢(shì)。15℃成熟4個(gè)月比5℃成熟相同時(shí)間干酪的水溶性多肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制程度顯著提高8.25%（P＜0.05），15℃成熟6個(gè)月干酪比5℃成熟相同時(shí)間的干酪的水溶性多肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制程度顯著提高6.80%（P＜0.05）。方差分析顯示，成熟溫度、時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪抑制金黃色葡萄球菌的效果顯著（P＜0.05）。

結(jié)合圖1和圖2，在成熟時(shí)間較短時(shí)，提高成熟溫度，干酪水溶性多肽對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果增加明顯，而成熟時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，提高成熟溫度后，干酪水溶性多肽對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果增加減緩。比較圖1、圖2發(fā)現(xiàn)，干酪水溶性多肽對(duì)大腸桿菌的抑制效果強(qiáng)于金黃色葡萄球菌。

2.4 成熟條件對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽抑制ACE活性的影響

由于ACE活性的增強(qiáng)能夠?qū)е聶C(jī)體血壓升高，因此本試驗(yàn)通過(guò)間接測(cè)定抑制ACE活性的效果來(lái)評(píng)價(jià)干酪水溶性多肽的降血壓作用。不同成熟溫度及時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽抑制ACE活性的結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 成熟溫度和時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性的影響Fig.3 Effect of ripening temperature and time on angiotensin converting enzyme inhibitory activity of soluble peptides in hard cheese made by yak milk

從圖3可知，5℃、10℃、15℃成熟的牦牛乳硬質(zhì)干酪，在4～6個(gè)月成熟過(guò)程中，其水溶性多肽對(duì)ACE的抑制率均呈現(xiàn)先減小后增大趨勢(shì)，且5℃、10℃、15℃成熟6個(gè)月干酪的水溶性多肽對(duì)ACE的抑制率比相同溫度成熟4、5個(gè)月干酪都高。SAITO T等[20]發(fā)現(xiàn)成熟24個(gè)月的Gouda干酪中ACE抑制活性（78.2%）強(qiáng)于成熟8個(gè)月的Gouda干酪（75.5%）。15℃成熟5個(gè)月干酪的水溶性多肽對(duì)ACE的抑制率比相同溫度成熟4個(gè)月干酪顯著降低3.30%（P＜0.05），而5℃成熟5個(gè)月干酪的水溶性多肽對(duì)ACE的抑制率比相同溫度條件下4個(gè)月干酪顯著降低8.55%（P＜0.05）。

當(dāng)成熟溫度從5℃提高至15℃時(shí)，干酪水溶性多肽對(duì)ACE抑制率呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。15℃成熟4個(gè)月干酪的水溶性多肽的ACE抑制率顯著比5℃成熟相同時(shí)間干酪提高3.35%（P＜0.05），而15℃成熟6個(gè)月干酪的水溶性多肽的ACE抑制率顯著比5℃成熟相同時(shí)間干酪提高7.07%（P＜0.05）。這主要是由于高溫成熟的牦牛乳硬質(zhì)干酪的蛋白質(zhì)降解程度高于低溫成熟干酪[11]。ONG L等[21]報(bào)道了添加益生菌附屬發(fā)酵劑、8℃成熟12周的Cheddar干酪中ACE抑制作用顯著強(qiáng)于4℃成熟干酪。SAHINGIL D等[22]研究發(fā)現(xiàn)，用瑞土乳桿菌（Lactobacillus helveticus）作為附屬發(fā)酵劑，12℃成熟的鹽腌干酪具有較高的ACE-I抑制肽含量。方差分析顯示，成熟溫度、時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽抑制ACE的作用顯著（P＜0.05）。

3 討論

生物活性肽的肽段在完整蛋白質(zhì)中沒(méi)有活性，一旦被酶降解后，將產(chǎn)生活性。對(duì)干酪而言，由于成熟過(guò)程中蛋白質(zhì)降解程度的不斷加深，產(chǎn)生的生物活性肽被進(jìn)一步降解，從而導(dǎo)致其功能特性喪失[23]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)成熟溫度和時(shí)間的變化引起牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽清除DPPH自由基、抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及ACE活性的能力發(fā)生變化。成熟溫度較高時(shí)，牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽抗氧化活性達(dá)到較強(qiáng)的成熟時(shí)間縮短，而成熟溫度降低時(shí)，干酪水溶性多肽抗氧化作用達(dá)到較強(qiáng)的時(shí)間延長(zhǎng)。成熟溫度從5℃提高至15℃時(shí)，干酪水溶性多肽對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及ACE的抑制作用呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)，且與蛋白質(zhì)降解程度顯現(xiàn)一定的相關(guān)性。

干酪成熟過(guò)程中蛋白質(zhì)降解處于復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化。隨著干酪中微生物的自溶[24]，部分生物活性肽又被降解。成熟6個(gè)月的Parmesan干酪中源自as1-酪蛋白降解的降血壓肽在成熟15個(gè)月干酪中未被發(fā)現(xiàn)[25]。干酪生物活性肽的產(chǎn)生與積累依賴于其成熟過(guò)程中蛋白質(zhì)降解所產(chǎn)生的肽的形成與降解間的平衡。提高牦牛乳硬質(zhì)干酪的成熟溫度導(dǎo)致干酪12%可溶性氮含量、親水性肽含量增多以及疏水性肽含量減少[11]，結(jié)合本試驗(yàn)的研究結(jié)果，在干酪成熟過(guò)程中，提高成熟溫度能夠?qū)е律锘钚噪墓δ苄詮?qiáng)或者含量高的生物活性肽提前釋放。但是，具體生物活性肽的結(jié)構(gòu)特征和性質(zhì)還有待于下一步研究。

4 結(jié)論

經(jīng)不同溫度和時(shí)間成熟的牦牛乳硬質(zhì)干酪的水溶性多肽具有抗氧化、抑菌和降血壓特性，且成熟溫度和時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽的生物活性有較大影響。成熟溫度、時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽的抗氧化作用具有極顯著影響（P＜0.01），對(duì)抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和ACE的影響顯著（P＜0.05）。5℃、10℃成熟5個(gè)月、15℃成熟4個(gè)月牦牛乳硬質(zhì)干酪的水溶性多肽對(duì)DPPH自由基清除率分別達(dá)到最高。5℃、10℃、15℃成熟的牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽在4～6個(gè)月成熟過(guò)程中對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制程度分別呈增強(qiáng)趨勢(shì)。成熟溫度從5℃提高至15℃時(shí)，牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性多肽的抑菌程度和ACE抑制率呈增強(qiáng)趨勢(shì)。