地衣多糖酶的研究進展

殷程程，楊述禎，岳慧娟，楊豐科*

（青島科技大學 化工學院，山東 青島 266042）

β-1,3-1,4-葡聚糖是谷物細胞壁和胚乳中的多糖成分，占谷物干質量的5.5%以上[1]，但是因為其溶解在水中具有很高的黏度[2]，使得谷物的利用率低，所以是抗營養(yǎng)因子。地衣多糖酶能夠特異性水解地衣多糖和β-1,3-1,4-葡聚糖[3]，從而降低谷物溶液的黏度，增加β-葡聚糖的消化率進而改善其轉化效率。地衣多糖酶可以很好的與洗衣粉、洗衣液兼容[4]，用于去除含有β-葡聚糖的食品和產(chǎn)品污漬；在歐洲，常使用地衣多糖酶分解大麥淀粉來生產(chǎn)燃料乙醇[5]。但是地衣多糖酶受到價格和質量的影響，目前市場上的地衣多糖酶不能滿足工業(yè)的要求。因此如何開發(fā)酶活力高和性質更好的地衣多糖酶仍是釀造、醫(yī)藥和飼料制造等企業(yè)的研究重點。國內(nèi)外的許多學者對地衣多糖酶進行了研究，本文對地衣多糖酶的來源、性質、應用以及酶活力測定方法進行了綜述，為地衣多糖酶的進一步研究提供了參考。

1 地衣多糖酶的來源

地衣多糖酶主要來源于微生物和植物[6-8]，其中細菌中的地衣多糖酶被報道的最廣泛、研究的最透徹。早期對產(chǎn)地衣多糖酶的研究集中在產(chǎn)酶菌種的篩選、產(chǎn)酶的條件優(yōu)化以及地衣多糖酶的酶學性質等。隨著更加深入的研究，發(fā)現(xiàn)來自天然的地衣多糖酶很難同時滿足工業(yè)生產(chǎn)中的溫度、pH和酶活力的要求。因此，近些年來地衣多糖酶的基因克隆和外源表達等不斷地被研究。隨著研究的不斷深入，人工改造地衣多糖酶將會受到廣泛關注。

產(chǎn)地衣多糖酶的細菌主要是芽孢桿菌，包括地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[9]、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）[10]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[11]、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）[12]、多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）[13]、巴倫氏類芽孢桿菌（Paenibacillusbarengoltzii）[14]等。此外，還有一些細菌，如甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）[15]和熱纖梭菌（Clostridiumthermocellum）[16-17]等也產(chǎn)地衣多糖酶。除了細菌之外，真菌也是地衣多糖酶的重要來源之一，如好氧真菌埃默森籃狀菌（Talaromyces emersonii）[18-19]、黑曲霉（Aspergillus niger）[20]、青霉屬（Penicillium）[21]、擬青霉（Paecilomyces）[22-23]和嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）[24]等，其中，來自橙色嗜熱子囊菌的地衣多糖酶的酶活力為3 741 U/mL，而且分別在pH 6.0和75℃條件下具有最高的活性。

2 地衣多糖酶的酶學性質

地衣多糖酶的來源廣泛，不同來源的地衣多糖酶有不同的性質。這種差異不僅表現(xiàn)在物種間，也表現(xiàn)在種屬間。大多數(shù)的地衣多糖酶都是胞外酶，常采用離心、超濾、沉淀、層析等方法進行分離純化。

真菌中的地衣多糖酶的最適pH一般為4.8～6.0，最適溫度為75～80℃，普遍具有耐酸、耐高溫的特點。真菌來源的地衣多糖酶的分子質量大多在30kDa～45kDa；其米氏常數(shù)（Km）也差異較大，一般為0.62～13.38 mg/mL，這表明真菌來源的不同地衣多糖酶與底物的親和性差異較大。目前有關真菌來源的地衣多糖酶的報道較少。MURRAY P G等[18]在2000年以麥麩和甜菜漿為碳源，從好氧真菌埃默森籃狀菌CBS 814.70中發(fā)酵得到地衣多糖酶，該酶是單一亞基糖蛋白，其分子質量和等電點值分別為（40.7±0.3）kDa和pH 4.4，在較寬的pH值和溫度范圍內(nèi)顯示出活性，其最佳pH值為4.8，最適溫度為80℃。該酶具有顯著的熱穩(wěn)定性，在100℃溫育15 min后剩余15%的原始活性；以地衣多糖和β-葡聚糖為底物時，該酶具有相同的米氏常數(shù)（Km）為13.38 mg/mL，而用地衣多糖的最大反應速率（Vmax）約為142.9 IU/mg，是用β-葡聚糖（79.3 IU/mg）獲得的值的2倍。ELGHARBI F等[20]以大麥粉為碳源，在黑曲霉US368中發(fā)酵得到新型的熱穩(wěn)定性的地衣多糖酶，該酶的分子質量為32 kDa，對葡聚糖的米氏常數(shù)（Km）為0.62 mg/mL，對地衣多糖的米氏常數(shù)（Km）為0.38 mg/mL。該酶的最適pH為5.0，最適溫度為60℃，具有顯著的熱穩(wěn)定性，在70℃時半衰期為30 min；在37℃條件下，該酶在pH 3～10條件下表現(xiàn)出100%的穩(wěn)定性。YAN Q等[24]以玉米芯為碳源，從嗜熱子囊菌CAU830中發(fā)酵得到地衣多糖酶，該酶的最高酶活力為3 741 U/mL，分子質量約為34 kDa，在pH6.0和75℃條件下分別具有最適活性，而且其表現(xiàn)出優(yōu)異的熱穩(wěn)定性，在50℃、60℃和70℃時熱變性半衰期分別為209min、130min、69min。該酶對大麥β-葡聚糖（13527U/mg）、燕麥β-葡聚糖（12 502 U/mg）和地衣多糖（9 225 U/mg）表現(xiàn)出嚴格的底物特異性，但對其他測試的多糖（包括昆布多糖、木聚糖、支鏈淀粉）沒有表現(xiàn)出活性。

細菌來源的地衣多糖酶的分子質量為25～75 kDa，最適溫度和最適pH值分別為50～70℃和5.0～7.0，米氏常數(shù)（Km）在1.82～8.00 mg/mL。ELGHARBI F等[10]從受污染的大麥樣品中分離出短小芽孢桿菌US570菌株，該菌株產(chǎn)生的地衣多糖酶的分子質量大小為75 kDa，該酶在廣泛的pH和溫度范圍內(nèi)具有活性，并有良好的熱穩(wěn)定性。在pH 3～9的范圍內(nèi)顯示出顯著的活性（超過50%的酶活性），在pH 6時具有最大活性；在溫度40～65℃之間酶活性超過80%，最適酶活溫度為55℃，而且在80℃條件下半衰期為30min。該酶是細菌地衣多糖酶中最先報道有三聚體結構的酶。FURTADOGP等[11]將枯草芽孢桿菌中的地衣多糖酶基因進行重組并在大腸桿菌中進行表達，產(chǎn)生的地衣多糖酶的最適溫度為50℃，最適pH為6.0，分子質量為28 kDa，米氏常數(shù)（Km）為（3.1±0.37）mg/mL。GAO Z[9]從花園土壤里分離出地衣芽孢桿菌并在該菌中純化出地衣多糖酶，該酶的分子質量為25 kDa，最適pH和溫度分別為6.5和60℃。米氏常數(shù)（Km）對于地衣多糖為5.11 mg/mL，對大麥β-葡聚糖為7.42 mg/mL，純化后酶的活性遠高于大多數(shù)報道的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性。

來自于細菌的地衣多糖酶的熱穩(wěn)定性普遍低于來源于真菌的地衣多糖酶，最適pH大多以中性為主，但是由于細菌來源的地衣多糖酶的種類多、表達量多、生產(chǎn)條件較成熟，目前廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)。而且隨著基因工程的發(fā)展，研究出越來越多高效表達地衣多糖酶的方法，這拓寬了地衣多糖酶的來源，同時降低了生產(chǎn)成本。

表1 不同來源的地衣多糖酶的性質Table 1 Properties of lichenase from different origins

3 地衣多糖酶的應用

3.1 食品和飼料添加劑

許多化工合成的抗微生物和抗氧化的防腐劑被添加到食品中用于控制微生物生長并延長食品的保質期。然而這些化學物質會影響健康，經(jīng)常食用含有化學防腐劑的食品會產(chǎn)生一些不利于身體健康的作用，如抗生素耐藥性和癌癥。因此提高消費者對更多天然食品或食品添加劑的認識，建議將具有益生菌特性的菌種作為天然防腐添加劑代替化學防腐添加劑。抗生素和抗菌生物補充劑如益生菌可以增加食物的保質期，提高營養(yǎng)價值，并且由于這些生物防腐劑具有治療效果，有利于消費者健康。益生菌長期以來一直用于食品加工，特別是用于牛奶、乳制品以及醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的天然食品添加劑。GUNYAKTI A等[28]研究了源自人母乳的加氏乳桿菌作為食品添加劑的潛在用途，證實了該菌不僅會抑制微生物的生長，而且其產(chǎn)生的地衣多糖酶可以幫助人體消化吸收營養(yǎng)物質。由于豬和其他禽類無法自發(fā)產(chǎn)生地衣多糖酶，當以大麥、燕麥等為飼料的主原料時，β-1,3-1,4-葡聚糖會作為抗營養(yǎng)因子影響它們對營養(yǎng)物質的吸收。在飼料中添加地衣多糖酶，可以降低谷物在動物體內(nèi)的黏度，有助于小腸吸收飼料中的營養(yǎng)物質，提高飼料的轉化率。在飼料生產(chǎn)加工過程中，熱處理是必不可少的，因此具有熱穩(wěn)定性的地衣多糖酶對于飼料加工行業(yè)來說有著非常重要的作用。

3.2 釀酒行業(yè)

在釀酒行業(yè)中，酒的澄清度、色度、香氣、口味和原麥汁濃度是鑒定酒質量好壞的標準。谷類是釀酒的主要原料之一，在釀造過程中對谷物的發(fā)酵處理決定著產(chǎn)品的質量。β-1,3-1,4-葡聚糖普遍存在于谷物胚乳和細胞壁中，在釀造過程中，內(nèi)源性地衣多糖酶會部分水解這些β-1,3-1,4-葡聚糖。然而在糖化過程中，糖化溫度升至76～78℃會使地衣多糖酶失活，剩余的未水解的高分子質量β-1,3-1,4-葡聚糖與水結合，使得麥芽液的黏度增大、過濾困難、形成明膠懸浮液，同時也使得麥芽的浸出率降低，這樣會降低酒的質量也增加了生產(chǎn)成本。GOLDENKOVA-PAVLOVAIV等[38]將B.terquilensisCGX 5-2的地衣多糖酶進行定點突變產(chǎn)生了酶的突變體，發(fā)現(xiàn)該酶的最佳溫度提高至70℃，并且與初始地衣多糖酶相比，該酶在酸性條件下的穩(wěn)定性超出了天然酶的370%和800%，而且催化活性增加了63%。在麥芽液中添加該改良過的地衣多糖酶，發(fā)現(xiàn)過濾時間和濾液黏度分別降低了21.3%和9.6%。NIU C等[39]用野生型地衣多糖酶、改良后的地衣多糖酶，發(fā)現(xiàn)添加野生型的酶、改良后的酶和商業(yè)酶分別將麥芽漿的過濾時間減少了8.4%、21.3%和16.8%同時將濾液黏度降低了3.5%、9.6%和7.9%。這表明改良后的酶在糖化中降解β-葡聚糖的性能優(yōu)于野生型和商業(yè)酶。CHAARI F等[29]研究了來自青霉Pol6菌株的地衣多糖酶，研究發(fā)現(xiàn)用來自青霉的地衣多糖酶處理麥芽液一段時間后，麥芽液的黏度和過濾時間與目前在釀造工業(yè)中使用的商業(yè)葡聚糖酶（Finizym）相比分別減少了1.82%、3.7%。NIU C等[30]將枯草芽孢桿菌中地衣多糖酶的基因提取、重組、導入到大腸桿菌中表達，產(chǎn)生的地衣多糖酶可以減少麥芽液的過濾時間和黏度。麥芽液的過濾時間和黏度分別從（202±3）s和（1.14±0.01）mPa·s減少至（142±2）s和（1.00±0.01）mPa/s，這比商業(yè)酶II（（168±2）s和（1.05±0.01）mPa·s）和商業(yè)酶Ⅰ（（146±1）s和（1.02±0.01）mPa·s）的效果更好。在釀造過程中添加地衣多糖酶不僅可以解決產(chǎn)品黏度大、沉淀多的問題，也降低了生產(chǎn)成本。因此地衣多糖酶分解β-1,3-1,4-葡聚糖的能力，使得它在釀造行業(yè)有著巨大的潛力。

3.3 地衣多糖酶的其他應用

地衣多糖酶除了應用在飼料和釀造行業(yè)之外，其可以降解β-1,3-1,4-葡聚糖和地衣多糖酶的特性也可以應用于洗滌劑、工業(yè)燃料等方面。CHAARI F等[4]已經(jīng)研究證明，地衣多糖酶在以漂白劑為主要成分的洗滌劑中表現(xiàn)出顯著的穩(wěn)定性。繼續(xù)研究了地衣多糖酶與洗滌劑的兼容性，發(fā)現(xiàn)地衣多糖酶與一些商業(yè)液體洗滌劑能夠相容且有一定的穩(wěn)定性。地衣多糖酶在液體洗滌劑Dinol和Ariel的存在下分別保留了約92%和80%的初始活動，但是其在SIC-linge洗滌劑存在下不太穩(wěn)定，保留了62%的活性。此外，其在一些商業(yè)固體洗滌劑中顯示出優(yōu)異的穩(wěn)定性和相容性，如在OMO、Nadhif和Fino洗滌劑中分別保留了其初始活性的約98%、97%和93%。然而，在Dixan洗滌劑的存在下，地衣多糖酶不太穩(wěn)定，僅有69%的初始活性。YANG S等[37]在嗜熱真菌中發(fā)現(xiàn)了新型的堿性地衣多糖酶，這也是最先報道的堿性地衣多糖酶，純化的酶在pH 10.0和55℃條件下具有最適活性，并且在較寬的pH（pH 4.0～10.0）范圍內(nèi)穩(wěn)定。該酶在常用洗滌劑的主要成分（包括Tween80、Triton×100、次氯酸鈉和H2O2）存在時表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性，保留了其原始活性的90%以上。該酶在一些商業(yè)液體和固體洗滌劑，如OMO（洗滌液）、藍月亮（洗滌液）、Fresh'nHygiene（洗滌液）、OMO（洗衣粉）、雕牌（洗衣粉）、汰漬（洗衣粉）和Super（天然皂粉）存在下分別保留了101%、97%、103%、106%、100%、90%和93%的酶活性。此外，該酶還在各種非離子表面活性劑和氧化劑中穩(wěn)定，因此，堿性地衣多糖酶可能有應用于多種工業(yè)的潛力，如洗滌劑、紙張和紙漿工業(yè)。DIVATE R等[5]研究了地衣多糖酶在生物燃料生產(chǎn)中的作用。實驗結果證明地衣多糖酶和β-葡萄糖苷酶在水解β-葡聚糖中有協(xié)同作用，提高糖化和發(fā)酵效率；耐熱酵母能夠在40℃條件下的分步水解發(fā)酵（separate hydrolysis andfermentation，SHF）模型中有效地將β-葡聚糖的酶促水解產(chǎn)物發(fā)酵成乙醇；固定化酵母能以100%發(fā)酵效率重復使用9個循環(huán)。這表明在地衣多糖酶的作用下，大麥中的β-葡聚糖可以很好的轉化為燃料乙醇，這大大降低了乙醇的生產(chǎn)成本。

4 地衣多糖酶的測定方法

目前，市場上的地衣多糖酶多而雜，酶質量也是良莠不齊。區(qū)分酶質量好壞的一個重要指標之一就是酶活力的大小，因此，一個靈敏度高、重復性好的酶活力檢測方法對酶工業(yè)的生產(chǎn)起著非常重要的作用[26]。MANGAN D等[27]旨在研究出可自動化測定地衣多糖酶活力的比色測定法這一新的測定酶活的新方法，首先研究了基于直接切割或酶偶聯(lián)底物的兩種測定形式，發(fā)現(xiàn)“直接裂解”底物，即4,6-O-亞芐基-2-氯-4-硝基苯基-β-31-纖維三糖基-β-吡喃葡萄糖苷這一底物是最經(jīng)常使用的。比色測定法的一個關鍵是寡糖和發(fā)色團的性質，另一個關鍵點在于通過改變發(fā)色基團的離去能力，從而調(diào)節(jié)底物的靈敏度。他們篩選出在一定的pKa條件（底物不發(fā)生自身水解且容易酶促切割）下易斷裂的發(fā)色團，通過在底物上連接上這一發(fā)色團形成新的底物MBG4。測定方法即將酶與MBG4底物混合，反應一段時間后在波長400 nm處測定吸光度值。

5 結語與展望

地衣多糖酶作為一種添加劑，有著顯著的經(jīng)濟和社會效益，也擁有著廣闊的開發(fā)前景。目前，國內(nèi)外也在不斷優(yōu)化產(chǎn)地衣多糖酶的菌種的發(fā)酵條件[31-32]，以期滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。但是目前的地衣多糖酶仍有一些不足，如熱穩(wěn)定性差、不耐酸耐堿、酶活力低等，不能滿足工業(yè)的需求。隨著基因工程和蛋白質工程的發(fā)展，許多研究者根據(jù)地衣多糖酶的結構信息對地衣多糖酶進行結構改造[33-34]、對地衣多糖酶的某個關鍵氨基酸進行定點突變[35-36]或將某種微生物的地衣多糖酶的基因進行外源表達[30]等，研究出了比市場上的酶更耐酸和耐高溫的酶。但是，這仍不能滿足工業(yè)上對地衣多糖酶的需求，因此新型地衣多糖酶的開發(fā)仍需研究。此外，目前國內(nèi)外所使用的酶活力測定方法多為人工手動測定，會產(chǎn)生許多使得實驗數(shù)據(jù)誤差變大的因素，而且對實驗操作者的要求很高。因此一種自動化測定酶活力的方法還有待研究。