茶多酚對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌組織中細(xì)胞凋亡的影響

張沙駱 王丹 王芳

(長(zhǎng)沙民政職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

現(xiàn)代競(jìng)技體育活動(dòng)中，運(yùn)動(dòng)疲勞是一種常見(jiàn)現(xiàn)象，運(yùn)動(dòng)疲勞不僅嚴(yán)重影響機(jī)體運(yùn)動(dòng)的能力，嚴(yán)重者甚至?xí)：C(jī)體健康〔1〕。運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生與骨骼肌細(xì)胞凋亡、氧化損傷等有關(guān)，尋找有效的方法降低骨骼肌細(xì)胞凋亡水平、提高運(yùn)動(dòng)能力是目前研究的重點(diǎn)〔2,3〕。茶多酚以?xún)翰杷仡?lèi)為主體，是一種多酚類(lèi)物質(zhì)，其具有抗衰老、預(yù)防肥胖、抗輻射等作用〔4〕。目前的研究顯示，茶多酚具有改善運(yùn)動(dòng)大鼠運(yùn)動(dòng)功能的作用，而對(duì)于其在骨骼肌細(xì)胞凋亡及對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后力竭運(yùn)動(dòng)大鼠運(yùn)動(dòng)能力的作用尚不明確〔5,6〕。本實(shí)驗(yàn)主要探討茶多酚對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡、運(yùn)動(dòng)能力等的影響，以期為緩解運(yùn)動(dòng)疲勞提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 3月齡SD雄性大鼠購(gòu)自中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重230～250 g，自由飲水，溫度20～24℃，濕度為40～55%，每天光照時(shí)間為12 h。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich；超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biovision；過(guò)氧化氫酶(CAT)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海榕柏生物技術(shù)有限公司；丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；羰基化蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cayman；活化型Caspase-3(酶切Caspase-3)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology；乳酸含量檢測(cè)試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞士Roche。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及運(yùn)動(dòng)方法 SD大鼠分成4組，分別為安靜組、訓(xùn)練組、茶多酚安靜組、茶多酚訓(xùn)練組，每組10只。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前5 d，訓(xùn)練組和茶多酚訓(xùn)練組進(jìn)行5 d的適應(yīng)性的跑臺(tái)訓(xùn)練(第1天，15 m/min，20 min；第2天，15 m/min，25 min；第3天，20 m/min，25 min；第4天，20 m/min，30 min；第5天，25 m/min，30 min)，適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束以后，按照25 m/min，30 min方式正式開(kāi)始跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，計(jì)為實(shí)驗(yàn)1 d，每周訓(xùn)練5 d，其中星期一和星期二休息，連續(xù)訓(xùn)練4 w。茶多酚訓(xùn)練組和茶多酚安靜組在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的前1 h，給予280 mg/kg的茶多酚灌胃處理。訓(xùn)練組和茶多酚訓(xùn)練組在最后1次運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練至力竭，力竭運(yùn)動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠不能維持跑臺(tái)設(shè)置的速度，大鼠隨著皮帶進(jìn)入到跑臺(tái)后端的擋板處，經(jīng)電刺激和毛刷驅(qū)趕均無(wú)效。記錄各組大鼠到達(dá)力竭的運(yùn)動(dòng)時(shí)間。安靜組、訓(xùn)練組給予等量的生理鹽水灌胃。安靜組、茶多酚安靜組不運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，只給予最后1次的力竭運(yùn)動(dòng)。

1.3組織和血液標(biāo)本采集 各組大鼠力竭運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，用乙醚將各組大鼠麻醉以后，斷頸，取5 ml血液，靜置30 min以后，3 000 r/min離心10 min，吸取上清溶液，保存在-20℃。同時(shí)取各組大鼠左右肢相同位置的腓腸肌，用冰預(yù)冷的生理鹽水洗滌以后，取一部分組織制作組織勻漿，剩余組織用于Western印跡、TUNEL法檢測(cè)。

1.4比色法檢測(cè)血乳酸含量 取1.3中的血清，用比色法檢測(cè)血清中乳酸含量，步驟同試劑盒說(shuō)明書(shū)，乳酸含量=(測(cè)定管的OD值-空白管的OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管的OD值-空白管的OD值)×標(biāo)準(zhǔn)濃度÷待測(cè)樣本濃度

1.5TUNEL法測(cè)定細(xì)胞凋亡 取1.3中大鼠骨骼肌組織，常規(guī)方法制作組織石蠟切片，用二甲苯浸泡2次以后，濃度梯度酒精中浸泡，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，加入Proteinase K工作液，孵育20 min，添加細(xì)胞通透液孵育8 min，經(jīng)PBS洗滌，添加TUNEL染色液，在暗濕盒中孵育60 min。PBS洗滌以后，添加50 μl的Converter-POD，繼續(xù)反應(yīng)30 min，滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物，在室溫中孵育10 min后，經(jīng)PBS洗滌，蘇木素染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，每個(gè)切片觀察500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)量，即為細(xì)胞凋亡率。

1.6Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞中酶切Caspase-3蛋白水平 取1.3中大鼠骨骼肌組織，剪碎后，添加裂解液，超聲破碎以后，充分裂解，置于4℃離心機(jī)，12 000 r/min離心10 min，取蛋白上清，保存在-80℃。按照聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白定量。將蛋白變性(蛋白樣品和5倍上樣緩沖液按照體積比為4∶1混勻煮沸5 min)處理，以每個(gè)泳道中加入30 μg蛋白樣品進(jìn)行電泳，電泳電壓為90 V恒壓，觀察溴酚藍(lán)染料進(jìn)入底部后，將電源關(guān)閉。取出凝膠，在90 V電壓條件下、冰浴將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上。用5% 牛血清白蛋白將NC膜在37℃孵育1.5 h封閉后，同一抗結(jié)合(1∶800稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜)、二抗結(jié)合(1∶2 000比例稀釋?zhuān)?7℃孵育1.5 h)后，用ECL法顯色。GAPDH作為參照，分析酶切Caspase-3蛋白水平。

1.7骨骼肌組織中抗氧化酶GSH-PX、SOD、CAT活性和羰基化蛋白、MDA含量檢測(cè) 取1.3中大鼠骨骼肌組織勻漿液，檢測(cè)組織勻漿液中GSH-PX活性(比色法)、SOD活性(黃嘌呤氧化酶法)、CAT活性(鉬酸銨比色法)和羰基化蛋白含量(比色法)、MDA含量(硫代巴比妥酸法)，步驟均同試劑盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)流程。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1茶多酚可明顯改善力竭運(yùn)動(dòng)大鼠運(yùn)動(dòng)能力 表1可見(jiàn)，訓(xùn)練組、茶多酚安靜組、茶多酚訓(xùn)練組力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間明顯高于安靜組，并且血乳酸值均明顯低于安靜組(均P<0.05)。茶多酚訓(xùn)練組力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間明顯高于茶多酚安靜組和訓(xùn)練組，血乳酸值均明顯低于茶多酚安靜組和訓(xùn)練組(均P<0.05)。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)合茶多酚可以明顯提高大鼠的運(yùn)動(dòng)能力。

表1 各組大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間和血乳酸含量比較

與安靜組比較:1)P<0.05；與茶多酚訓(xùn)練組比較:2)P<0.05，下表同

2.2茶多酚可明顯降低力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌組織中細(xì)胞凋亡和酶切Caspase-3蛋白表達(dá)水平 圖1和表2所示，訓(xùn)練組、茶多酚安靜組、茶多酚訓(xùn)練組大鼠骨骼肌組織中細(xì)胞凋亡水平明顯低于安靜組，酶切Caspase-3蛋白水平也明顯低于安靜組(均P<0.05)。茶多酚訓(xùn)練組骨骼肌組織中細(xì)胞凋亡水平明顯低于茶多酚安靜組和訓(xùn)練組，酶切Caspase-3蛋白水平也明顯低于茶多酚安靜組和訓(xùn)練組(均P<0.05)。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)合茶多酚可以明顯減少力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡。

1～4：安靜組、訓(xùn)練組、茶多酚安靜組、茶多酚訓(xùn)練組圖1 Western印跡檢測(cè)大鼠骨骼肌組織中酶切Caspase-3蛋白水平

2.3茶多酚可明顯提高力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌組織中抗氧化酶GSH-PX、SOD、CAT活性 表3所示，訓(xùn)練組、茶多酚安靜組、茶多酚訓(xùn)練組大鼠骨骼肌組織中抗氧化酶GSH-PX、SOD、CAT活性明顯高于安靜組(均P<0.05)。茶多酚訓(xùn)練組骨骼肌組織中抗氧化酶GSH-PX、SOD、CAT活性明顯高于茶多酚安靜組和訓(xùn)練組。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)合茶多酚可以明顯提高力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌組織的抗氧化能力。

組別SOD(U/mg)CAT(U/mg)GSH-PX(U/mg)羰基化蛋白(nmol/mg)MDA(nmol/mg)安靜組81.58±8.565.47±0.57170.46±13.2712.56±1.1622.14±2.63訓(xùn)練組108.89±10.581)2)7.52±0.821)2)206.36±11.021)2)8.89±0.961)2)14.75±1.321)2)茶多酚安靜組104.25±9.521)2)6.58±0.411)2)197.02±11.351)2)9.95±1.101)2)16.24±1.451)2)茶多酚訓(xùn)練組131.54±11.481)9.66±1.011)241.63±13.581)7.02±0.851)12.01±1.201)F/P值41.173/0.00057.867/0.00056.653/0.00050.939/0.00060.007/0.000

2.4茶多酚可明顯減輕力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌組織的氧化損傷 表3所示，訓(xùn)練組、茶多酚安靜組、茶多酚訓(xùn)練組大鼠骨骼肌組織中羰基化蛋白和MDA含量明顯低于安靜組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。茶多酚訓(xùn)練組骨骼肌組織中羰基化蛋白和MDA含量明顯低于茶多酚安靜組和訓(xùn)練組(均P<0.05)。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)合茶多酚可以減輕力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌組織氧化損傷。

3 討 論

茶多酚具有多種藥理學(xué)作用和生物學(xué)活性，其具有顯著的抗氧化、抗疲勞等作用，研究報(bào)道顯示，茶多酚具有改善機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力的功效，其一方面可以提高機(jī)體對(duì)抗運(yùn)動(dòng)疲勞的能力，另外，茶多酚還具有提高運(yùn)動(dòng)大鼠抗氧化酶活性的作用〔7〕。力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間的長(zhǎng)短是衡量生命體抗疲勞能力、運(yùn)動(dòng)能力的重要指標(biāo)，力竭時(shí)間越長(zhǎng)，機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力也就越強(qiáng)〔8〕。骨骼肌是運(yùn)動(dòng)過(guò)程中乳酸產(chǎn)生的主要部位，其過(guò)度積累能夠誘導(dǎo)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，運(yùn)動(dòng)過(guò)程中血液乳酸含量變化是乳酸清除和乳酸生成的平衡結(jié)果，其水平的高低與機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力有關(guān)〔9,10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茶多酚不僅具有提高大鼠運(yùn)動(dòng)能力的作用，還能夠提高運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠運(yùn)動(dòng)能力。

骨骼肌細(xì)胞凋亡與運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生密切相關(guān)，運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生往往伴隨著機(jī)體抗氧化能力的降低，而機(jī)體抗氧化能力的降低與組織中抗氧化酶活性、氧自由基的過(guò)多聚集有關(guān)，過(guò)量的氧自由基可以誘發(fā)Caspase凋亡反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔11～13〕。Caspase-3是Caspase凋亡反應(yīng)下游的執(zhí)行因子，其活化后標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆的階段〔14〕。MDA是脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化的產(chǎn)物，其表達(dá)水平升高是組織氧化損傷的標(biāo)志，GSH-PX、SOD、CAT是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，其活性的高低與機(jī)體內(nèi)氧化平衡狀態(tài)的維持具有密切關(guān)系〔15～18〕。羰基化蛋白是機(jī)體中的蛋白質(zhì)受到脂質(zhì)過(guò)氧化等作用產(chǎn)生的活性羰基類(lèi)物質(zhì)，羰基化修飾的蛋白質(zhì)表達(dá)水平升高標(biāo)志著組織氧化損傷的發(fā)生〔19〕。茶多酚具有抗氧化作用，其可以提高大鼠抗氧化能力〔20〕。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，茶多酚可能通過(guò)減輕力竭運(yùn)動(dòng)大鼠氧化損傷減少骨骼肌組織細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，茶多酚還能夠協(xié)同運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練提高力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌組織抗氧化能力，進(jìn)一步減少骨骼肌細(xì)胞凋亡發(fā)生，說(shuō)明茶多酚不僅可以通過(guò)抗氧化損傷抑制骨骼肌細(xì)胞凋亡發(fā)生，還可以協(xié)同運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練減少力竭運(yùn)動(dòng)大鼠損傷。

總而言之，茶多酚能夠增加大鼠運(yùn)動(dòng)能力，茶多酚通過(guò)增加力竭運(yùn)動(dòng)大鼠抗氧化能力減少骨骼肌細(xì)胞凋亡，另外，茶多酚還能夠協(xié)同運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練改善大鼠的運(yùn)動(dòng)能力，這為提高機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力提供了新方向。本研究只選用了一種濃度的茶多酚處理力竭運(yùn)動(dòng)大鼠，后續(xù)會(huì)探討不同濃度的茶多酚在力竭運(yùn)動(dòng)大鼠中的作用，為茶多酚提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。