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    茶多酚對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌組織中細(xì)胞凋亡的影響

    2019-07-30 06:31:50張沙駱王丹王芳
    中國(guó)老年學(xué)雜志 2019年14期
    關(guān)鍵詞:力竭訓(xùn)練組茶多酚

    張沙駱 王丹 王芳

    (長(zhǎng)沙民政職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410004)

    現(xiàn)代競(jìng)技體育活動(dòng)中,運(yùn)動(dòng)疲勞是一種常見(jiàn)現(xiàn)象,運(yùn)動(dòng)疲勞不僅嚴(yán)重影響機(jī)體運(yùn)動(dòng)的能力,嚴(yán)重者甚至?xí):C(jī)體健康〔1〕。運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生與骨骼肌細(xì)胞凋亡、氧化損傷等有關(guān),尋找有效的方法降低骨骼肌細(xì)胞凋亡水平、提高運(yùn)動(dòng)能力是目前研究的重點(diǎn)〔2,3〕。茶多酚以?xún)翰杷仡?lèi)為主體,是一種多酚類(lèi)物質(zhì),其具有抗衰老、預(yù)防肥胖、抗輻射等作用〔4〕。目前的研究顯示,茶多酚具有改善運(yùn)動(dòng)大鼠運(yùn)動(dòng)功能的作用,而對(duì)于其在骨骼肌細(xì)胞凋亡及對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后力竭運(yùn)動(dòng)大鼠運(yùn)動(dòng)能力的作用尚不明確〔5,6〕。本實(shí)驗(yàn)主要探討茶多酚對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡、運(yùn)動(dòng)能力等的影響,以期為緩解運(yùn)動(dòng)疲勞提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1材料 3月齡SD雄性大鼠購(gòu)自中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體重230~250 g,自由飲水,溫度20~24℃,濕度為40~55%,每天光照時(shí)間為12 h。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich;超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biovision;過(guò)氧化氫酶(CAT)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海榕柏生物技術(shù)有限公司;丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;羰基化蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cayman;活化型Caspase-3(酶切Caspase-3)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology;乳酸含量檢測(cè)試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞士Roche。

    1.2實(shí)驗(yàn)分組及運(yùn)動(dòng)方法 SD大鼠分成4組,分別為安靜組、訓(xùn)練組、茶多酚安靜組、茶多酚訓(xùn)練組,每組10只。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前5 d,訓(xùn)練組和茶多酚訓(xùn)練組進(jìn)行5 d的適應(yīng)性的跑臺(tái)訓(xùn)練(第1天,15 m/min,20 min;第2天,15 m/min,25 min;第3天,20 m/min,25 min;第4天,20 m/min,30 min;第5天,25 m/min,30 min),適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束以后,按照25 m/min,30 min方式正式開(kāi)始跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練,計(jì)為實(shí)驗(yàn)1 d,每周訓(xùn)練5 d,其中星期一和星期二休息,連續(xù)訓(xùn)練4 w。茶多酚訓(xùn)練組和茶多酚安靜組在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的前1 h,給予280 mg/kg的茶多酚灌胃處理。訓(xùn)練組和茶多酚訓(xùn)練組在最后1次運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練至力竭,力竭運(yùn)動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)為:大鼠不能維持跑臺(tái)設(shè)置的速度,大鼠隨著皮帶進(jìn)入到跑臺(tái)后端的擋板處,經(jīng)電刺激和毛刷驅(qū)趕均無(wú)效。記錄各組大鼠到達(dá)力竭的運(yùn)動(dòng)時(shí)間。安靜組、訓(xùn)練組給予等量的生理鹽水灌胃。安靜組、茶多酚安靜組不運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練,只給予最后1次的力竭運(yùn)動(dòng)。

    1.3組織和血液標(biāo)本采集 各組大鼠力竭運(yùn)動(dòng)結(jié)束后,用乙醚將各組大鼠麻醉以后,斷頸,取5 ml血液,靜置30 min以后,3 000 r/min離心10 min,吸取上清溶液,保存在-20℃。同時(shí)取各組大鼠左右肢相同位置的腓腸肌,用冰預(yù)冷的生理鹽水洗滌以后,取一部分組織制作組織勻漿,剩余組織用于Western印跡、TUNEL法檢測(cè)。

    1.4比色法檢測(cè)血乳酸含量 取1.3中的血清,用比色法檢測(cè)血清中乳酸含量,步驟同試劑盒說(shuō)明書(shū),乳酸含量=(測(cè)定管的OD值-空白管的OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管的OD值-空白管的OD值)×標(biāo)準(zhǔn)濃度÷待測(cè)樣本濃度

    1.5TUNEL法測(cè)定細(xì)胞凋亡 取1.3中大鼠骨骼肌組織,常規(guī)方法制作組織石蠟切片,用二甲苯浸泡2次以后,濃度梯度酒精中浸泡,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,加入Proteinase K工作液,孵育20 min,添加細(xì)胞通透液孵育8 min,經(jīng)PBS洗滌,添加TUNEL染色液,在暗濕盒中孵育60 min。PBS洗滌以后,添加50 μl的Converter-POD,繼續(xù)反應(yīng)30 min,滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物,在室溫中孵育10 min后,經(jīng)PBS洗滌,蘇木素染色,光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況,每個(gè)切片觀察500個(gè)細(xì)胞,計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)量,即為細(xì)胞凋亡率。

    1.6Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞中酶切Caspase-3蛋白水平 取1.3中大鼠骨骼肌組織,剪碎后,添加裂解液,超聲破碎以后,充分裂解,置于4℃離心機(jī),12 000 r/min離心10 min,取蛋白上清,保存在-80℃。按照聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白定量。將蛋白變性(蛋白樣品和5倍上樣緩沖液按照體積比為4∶1混勻煮沸5 min)處理,以每個(gè)泳道中加入30 μg蛋白樣品進(jìn)行電泳,電泳電壓為90 V恒壓,觀察溴酚藍(lán)染料進(jìn)入底部后,將電源關(guān)閉。取出凝膠,在90 V電壓條件下、冰浴將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上。用5% 牛血清白蛋白將NC膜在37℃孵育1.5 h封閉后,同一抗結(jié)合(1∶800稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜)、二抗結(jié)合(1∶2 000比例稀釋?zhuān)?7℃孵育1.5 h)后,用ECL法顯色。GAPDH作為參照,分析酶切Caspase-3蛋白水平。

    1.7骨骼肌組織中抗氧化酶GSH-PX、SOD、CAT活性和羰基化蛋白、MDA含量檢測(cè) 取1.3中大鼠骨骼肌組織勻漿液,檢測(cè)組織勻漿液中GSH-PX活性(比色法)、SOD活性(黃嘌呤氧化酶法)、CAT活性(鉬酸銨比色法)和羰基化蛋白含量(比色法)、MDA含量(硫代巴比妥酸法),步驟均同試劑盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)流程。

    1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

    2 結(jié) 果

    2.1茶多酚可明顯改善力竭運(yùn)動(dòng)大鼠運(yùn)動(dòng)能力 表1可見(jiàn),訓(xùn)練組、茶多酚安靜組、茶多酚訓(xùn)練組力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間明顯高于安靜組,并且血乳酸值均明顯低于安靜組(均P<0.05)。茶多酚訓(xùn)練組力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間明顯高于茶多酚安靜組和訓(xùn)練組,血乳酸值均明顯低于茶多酚安靜組和訓(xùn)練組(均P<0.05)。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)合茶多酚可以明顯提高大鼠的運(yùn)動(dòng)能力。

    表1 各組大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間和血乳酸含量比較

    與安靜組比較:1)P<0.05;與茶多酚訓(xùn)練組比較:2)P<0.05,下表同

    2.2茶多酚可明顯降低力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌組織中細(xì)胞凋亡和酶切Caspase-3蛋白表達(dá)水平 圖1和表2所示,訓(xùn)練組、茶多酚安靜組、茶多酚訓(xùn)練組大鼠骨骼肌組織中細(xì)胞凋亡水平明顯低于安靜組,酶切Caspase-3蛋白水平也明顯低于安靜組(均P<0.05)。茶多酚訓(xùn)練組骨骼肌組織中細(xì)胞凋亡水平明顯低于茶多酚安靜組和訓(xùn)練組,酶切Caspase-3蛋白水平也明顯低于茶多酚安靜組和訓(xùn)練組(均P<0.05)。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)合茶多酚可以明顯減少力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡。

    1~4:安靜組、訓(xùn)練組、茶多酚安靜組、茶多酚訓(xùn)練組圖1 Western印跡檢測(cè)大鼠骨骼肌組織中酶切Caspase-3蛋白水平

    2.3茶多酚可明顯提高力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌組織中抗氧化酶GSH-PX、SOD、CAT活性 表3所示,訓(xùn)練組、茶多酚安靜組、茶多酚訓(xùn)練組大鼠骨骼肌組織中抗氧化酶GSH-PX、SOD、CAT活性明顯高于安靜組(均P<0.05)。茶多酚訓(xùn)練組骨骼肌組織中抗氧化酶GSH-PX、SOD、CAT活性明顯高于茶多酚安靜組和訓(xùn)練組。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)合茶多酚可以明顯提高力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌組織的抗氧化能力。

    組別SOD(U/mg)CAT(U/mg)GSH-PX(U/mg)羰基化蛋白(nmol/mg)MDA(nmol/mg)安靜組81.58±8.565.47±0.57170.46±13.2712.56±1.1622.14±2.63訓(xùn)練組108.89±10.581)2)7.52±0.821)2)206.36±11.021)2)8.89±0.961)2)14.75±1.321)2)茶多酚安靜組104.25±9.521)2)6.58±0.411)2)197.02±11.351)2)9.95±1.101)2)16.24±1.451)2)茶多酚訓(xùn)練組131.54±11.481)9.66±1.011)241.63±13.581)7.02±0.851)12.01±1.201)F/P值41.173/0.00057.867/0.00056.653/0.00050.939/0.00060.007/0.000

    2.4茶多酚可明顯減輕力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌組織的氧化損傷 表3所示,訓(xùn)練組、茶多酚安靜組、茶多酚訓(xùn)練組大鼠骨骼肌組織中羰基化蛋白和MDA含量明顯低于安靜組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。茶多酚訓(xùn)練組骨骼肌組織中羰基化蛋白和MDA含量明顯低于茶多酚安靜組和訓(xùn)練組(均P<0.05)。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)合茶多酚可以減輕力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌組織氧化損傷。

    3 討 論

    茶多酚具有多種藥理學(xué)作用和生物學(xué)活性,其具有顯著的抗氧化、抗疲勞等作用,研究報(bào)道顯示,茶多酚具有改善機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力的功效,其一方面可以提高機(jī)體對(duì)抗運(yùn)動(dòng)疲勞的能力,另外,茶多酚還具有提高運(yùn)動(dòng)大鼠抗氧化酶活性的作用〔7〕。力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間的長(zhǎng)短是衡量生命體抗疲勞能力、運(yùn)動(dòng)能力的重要指標(biāo),力竭時(shí)間越長(zhǎng),機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力也就越強(qiáng)〔8〕。骨骼肌是運(yùn)動(dòng)過(guò)程中乳酸產(chǎn)生的主要部位,其過(guò)度積累能夠誘導(dǎo)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡,運(yùn)動(dòng)過(guò)程中血液乳酸含量變化是乳酸清除和乳酸生成的平衡結(jié)果,其水平的高低與機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力有關(guān)〔9,10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,茶多酚不僅具有提高大鼠運(yùn)動(dòng)能力的作用,還能夠提高運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠運(yùn)動(dòng)能力。

    骨骼肌細(xì)胞凋亡與運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生密切相關(guān),運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生往往伴隨著機(jī)體抗氧化能力的降低,而機(jī)體抗氧化能力的降低與組織中抗氧化酶活性、氧自由基的過(guò)多聚集有關(guān),過(guò)量的氧自由基可以誘發(fā)Caspase凋亡反應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔11~13〕。Caspase-3是Caspase凋亡反應(yīng)下游的執(zhí)行因子,其活化后標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆的階段〔14〕。MDA是脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化的產(chǎn)物,其表達(dá)水平升高是組織氧化損傷的標(biāo)志,GSH-PX、SOD、CAT是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶,其活性的高低與機(jī)體內(nèi)氧化平衡狀態(tài)的維持具有密切關(guān)系〔15~18〕。羰基化蛋白是機(jī)體中的蛋白質(zhì)受到脂質(zhì)過(guò)氧化等作用產(chǎn)生的活性羰基類(lèi)物質(zhì),羰基化修飾的蛋白質(zhì)表達(dá)水平升高標(biāo)志著組織氧化損傷的發(fā)生〔19〕。茶多酚具有抗氧化作用,其可以提高大鼠抗氧化能力〔20〕。

    本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,茶多酚可能通過(guò)減輕力竭運(yùn)動(dòng)大鼠氧化損傷減少骨骼肌組織細(xì)胞凋亡,實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn),茶多酚還能夠協(xié)同運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練提高力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌組織抗氧化能力,進(jìn)一步減少骨骼肌細(xì)胞凋亡發(fā)生,說(shuō)明茶多酚不僅可以通過(guò)抗氧化損傷抑制骨骼肌細(xì)胞凋亡發(fā)生,還可以協(xié)同運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練減少力竭運(yùn)動(dòng)大鼠損傷。

    總而言之,茶多酚能夠增加大鼠運(yùn)動(dòng)能力,茶多酚通過(guò)增加力竭運(yùn)動(dòng)大鼠抗氧化能力減少骨骼肌細(xì)胞凋亡,另外,茶多酚還能夠協(xié)同運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練改善大鼠的運(yùn)動(dòng)能力,這為提高機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力提供了新方向。本研究只選用了一種濃度的茶多酚處理力竭運(yùn)動(dòng)大鼠,后續(xù)會(huì)探討不同濃度的茶多酚在力竭運(yùn)動(dòng)大鼠中的作用,為茶多酚提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

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