金鐵鎖優(yōu)質(zhì)種源組織培養(yǎng)研究

戚淑威，和桂青，周國華，和建英，程遠輝，和瓊姬，趙文林，陳 翠*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院 高山經(jīng)濟植物研究所，云南 麗江 674199;2.云南白藥集團太安生物科技產(chǎn)業(yè)有限公司，云南 麗江 674199)

金鐵鎖(PsammosilenetunicoidesW. C. Wu et C. Y. Wu)為石竹科金鐵鎖屬多年生植物，別名獨定子、昆明沙參、蜈蚣七、金絲矮陀陀等，是分布在中國西南地區(qū)的特有單種屬植物[1-3]，屬于國家二級保護植物，現(xiàn)已作為珍稀瀕危物種列于《中國植物紅皮書中》[4-5]。集中分布在橫斷山區(qū)內(nèi)，即滇西北的麗江、寧蒗、永勝、鶴慶、劍川、洱源、賓川、德欽、香格里拉、維西、蘭坪和川西南的芒康、巴塘、稻城、鄉(xiāng)城、得榮、木里、鹽源、米易等地。此區(qū)域是金鐵鎖的分布中心。同時云南中部的東川、尋甸、武定、富民、昆明、易門、江川，東北部的會澤、宣威和貴州西北部的赫章、威寧也是一個相對集中的分布區(qū)域。而西藏東南部的林芝、察隅，滇南的個舊、紅河及滇西的保山也有零星分布[6-7]。以根莖入藥，具有除風濕、定痛、止血、祛瘀的功效，用于治療風濕痹痛、胃痛、創(chuàng)傷初學、跌打損傷等[8-10]，同時也是云南紅藥膠囊、腫痛氣霧劑、金骨蓮膠囊、百寶丹膠囊等中成藥的主要原料[11-12]。

金鐵鎖屬于多年生草本植物，野生資源已瀕臨滅絕，目前的繁殖方式主要為人工栽培，生產(chǎn)上主要的繁殖方式為種子繁殖[13-19]，需要種植3～4年才能采收，然而我們在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，種植2年后金鐵鎖就開始出現(xiàn)不同程度的爛根現(xiàn)象，有時甚至絕收。我們針對這一現(xiàn)象進行了系統(tǒng)的研究和分析，發(fā)現(xiàn)金鐵鎖爛根的現(xiàn)象除與水分管理和病害有關(guān)外[20]，還與金鐵鎖的種源優(yōu)劣有關(guān)，因此，本團隊從西南各地區(qū)采集了50多份金鐵鎖種源，通過大小、重量、產(chǎn)量、抗病性等多方面的對比初步優(yōu)選出5個金鐵鎖優(yōu)質(zhì)種源，具有根莖顏色黃褐色、粗壯、分支少、無病害等優(yōu)點，為了穩(wěn)定遺傳金鐵鎖優(yōu)質(zhì)種源的優(yōu)良性狀，本團隊對其中一個金鐵鎖優(yōu)質(zhì)種源進行了組織培養(yǎng)，希望通過組培的方式獲得大量的金鐵鎖優(yōu)質(zhì)種源組培苗，用于解決金鐵鎖實際生產(chǎn)中所面臨的瓶頸問題。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以金鐵鎖優(yōu)質(zhì)種源新鮮根莖為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 室內(nèi)催芽 將金鐵鎖優(yōu)質(zhì)種源的新鮮根莖進行初步篩選，剔除弱、病、傷根，洗去泥沙，放入經(jīng)過消毒處理的濕度為40%左右的粗木屑中，放置于20 ℃培養(yǎng)箱中催芽，待嫩莖長至15～18 cm時備用。

1.2.2 不同消毒時間處理 將莖芽從蘆頭基部切斷，用剪刀剪成帶1對腋芽的小莖段，放入燒杯中，燒杯中加入1/2的水和少許洗潔精，搖勻靜置5 min，隨后放在流水下沖洗1 h，淋干水分后，30個為一組，分別放入4個滅菌的燒杯中，按表1所示進行消毒處理，隨后用無菌水清洗3～5次后接種于MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中，每處理10瓶，3個重復。觀察和統(tǒng)計不同消毒處理下的污染率及成活率，計算公式如下：

污染率/%=污染苗數(shù)/總苗數(shù)×100%

成活率/%=成活苗數(shù)/總苗數(shù)×100%

表1 金鐵鎖外植體消毒處理方案

1.2.3 叢生芽誘導培養(yǎng) 將金鐵鎖莖段接入不同濃度的6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基中，激素濃度如表2所示，培養(yǎng)條件為：溫度(23±2)℃，濕度30%～40%，光照強度2000 lx，光照時間10 h/d。觀察并記錄叢生芽個數(shù)、莖節(jié)長度、葉片數(shù)、株高及新生芽生長情況等。每瓶1苗，每組10瓶，3個重復。

表2 金鐵鎖叢生芽誘導試驗方案

1.2.4 增殖培養(yǎng) 增殖培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為叢生芽誘導最佳培養(yǎng)基，記錄最大增殖倍數(shù)。

1.2.5 生根培養(yǎng) 在1/2MS培養(yǎng)基中加入不同濃度的NAA和IBA，如表3所示，觀察不同濃度激素配比對金鐵鎖不定芽生根的影響，培養(yǎng)條件同上，觀察并記錄不定芽株高、葉數(shù)、根長、生根率等。每瓶10苗，10瓶為一處理，3個重復。生根率計算公式如下：

生根率/%=生根的莖數(shù)/接種的莖總數(shù)×100%

表3 金鐵鎖生根培養(yǎng)試驗方案

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)催芽

將金鐵鎖新鮮根莖進行初步篩選、剔除弱、病、傷根，洗去泥沙，放入經(jīng)過消毒處理的濕度為40%左右的粗木屑中，置于20 ℃培養(yǎng)箱中催芽。培養(yǎng)至3 d時可見蘆頭上的潛伏芽變綠并開始長大，20 d時嫩莖可達到15～18 cm，嫩莖白色，粗壯，葉片幾乎完全展開，此時的嫩莖作為組培材料備用。

2.2 不同時間消毒處理

不同消毒處理結(jié)果如表4所示，4種消毒方案對金鐵鎖外植體的污染菌均有一定的殺菌作用。其中處理3的消毒方案最好，可以使污染率降至10%，成活率可達到93.3%，而處理4的污染率雖然很低，但小苗出現(xiàn)輕微褐化，成活率也有所降低，因此金鐵鎖外植體的最佳消毒方法為75%乙醇消毒30 s+0.1% HgCl2消毒8 min。

表4 不同消毒處理對金鐵鎖外植體消毒的效果比較

2.3 叢生芽誘導培養(yǎng)

將金鐵鎖外植體接入不同的叢生芽誘導培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)室中培養(yǎng)30 d后觀察并記錄叢生芽個數(shù)、莖節(jié)長度、葉片數(shù)、株高及新生芽生長情況等，如表5所示，當單獨添加NAA時，隨著濃度的增加，可以產(chǎn)生大量的愈傷組織，但愈傷組織不能分化成叢生芽，激素組合均可誘導愈傷組織的產(chǎn)生，其中7號激素組合獲得叢生芽最好，叢生芽數(shù)量平均可達到11.6個。如圖1所示，莖節(jié)長度1.8 cm，長度適中，葉片綠色，數(shù)量多，平均可達到58片，株高可達到4.4 cm，除基部接近培養(yǎng)基的2葉增大變形外，其余葉片均正常；當6-BA的濃度達到1.5 mg/L時，雖然可產(chǎn)生大量愈傷組織，也可誘導叢生芽的產(chǎn)生，但產(chǎn)生的叢生芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。因此，6-BA的濃度不宜超過1.5 mg/L，根據(jù)試驗結(jié)果得到金鐵鎖叢生芽的最佳誘導培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

圖1 叢生芽

表5 金鐵鎖叢生芽誘導結(jié)果

2.4 增殖培養(yǎng)

將叢生芽二次轉(zhuǎn)接至叢生芽誘導培養(yǎng)基中，最大增殖倍數(shù)可達到29。

2.5 生根培養(yǎng)

將增殖的莖芽剪成帶1對腋芽的莖段接入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)至15 d時，部分莖基部開始膨大，莖皮脹開，呈紫色(生根前期)，如圖2所示。30～40 d時開始生根，60 d時生根明顯，須根觸須狀，3～5條，如圖3所示，90 d時記錄生根率、根長、株高、葉數(shù)等，結(jié)果如表6所示，不同激素配比對不定芽生根均有促進作用，處理9和處理10的平均株高可達11 cm以上，植株生長速度較快，但生根率不高，分別僅為36%和62%，而處理6的生根率可達到93%，平均株高可達到10.2 cm,平均葉片對數(shù)可達到9對，根長較均勻。因此，金鐵鎖的最佳生根培養(yǎng)基配方為：1/2MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.3 mg/L。

圖2 生根前期(15 d)

圖3 生根初期(60 d)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，外植體的取材部位應盡量選擇中斷幼嫩的莖段，不宜選擇最上部分的嫰尖和最下部分的莖段，因為莖段太嫩易發(fā)生消毒時間太長所產(chǎn)生的褐化現(xiàn)象，最下部分的莖段因為接觸地表，攜帶的病菌較多，易發(fā)生由于消毒不徹底而產(chǎn)生的污染問題，這與李巖[21]、陳杰[22]等的研究結(jié)果基本一致。在選擇好莖段后應將葉片去除，僅保留葉片基部，防止后期葉片膨大變形，同時有利于腋芽的產(chǎn)生，促進植株的生長。除此之外，莖段插入培養(yǎng)基中不宜過深或過淺。

表6 金鐵鎖生根誘導結(jié)果

注：株高、葉數(shù)信息為平均值；根長等為最長和最短根長范圍。

金鐵鎖組培過程中產(chǎn)生2種根型：一種為氣生根，一種為基內(nèi)根。氣生根白色、絲狀、數(shù)量極多，生長速度極快，生長于培養(yǎng)基的上面，當以葉片、燙傷莖段為組織材料時，或莖段未插入培養(yǎng)基中時易產(chǎn)生大量的氣生根，經(jīng)觀察，產(chǎn)生氣生根的組培苗生長緩慢，長勢較差，往往覆蓋于整個培養(yǎng)基表面，因此氣生根的作用有待進一步的研究?；鶅?nèi)根為金鐵鎖不定芽接入培養(yǎng)基后，在培養(yǎng)基內(nèi)形成由下端莖段分化而成的根，初期呈觸須狀，隨后延伸生長，后期可見根上有側(cè)根產(chǎn)生，為金鐵鎖組培過程中的主要根型，產(chǎn)生基內(nèi)根的組培苗健壯、長勢較好。