干旱脅迫對豬苓菌絲生長及多糖合成相關(guān)酶活性的影響

徐夢馨，郭宏波，廉 冬，馬珍璐，張躍進，孫建華

(1. 西北農(nóng)林科技大學 化學與藥學院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌 712100；3.陜西漢王略陽中藥科技有限公司，陜西略陽 724300)

豬苓[Polyporusumbellatus(Pers.) Fries]為多孔菌科藥用真菌，別名豬屎苓、豬茯苓、野豬糞等，以干燥菌核入藥，歸腎、膀胱經(jīng)，具有利水滲濕功效，臨床常用于治療小便不利、水腫、泄瀉、淋濁和帶下等癥[1]。研究發(fā)現(xiàn)，豬苓中含有豬苓多糖、甾體等多種有效成分[2]，其中豬苓多糖可以提高機體免疫力，并通過抗氧化抑制腫瘤細胞增殖，誘導其凋亡，從而抑制腫瘤基因表達[3-8]。

隨著豬苓多糖抗癌作用的發(fā)現(xiàn)以及中國醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展,以豬苓為原料的成品藥也不斷開發(fā),豬苓藥材市場需求呈增加趨勢，有關(guān)豬苓的研究及人工栽培備受關(guān)注[9]。然而，目前豬苓的生物學特性尚不完全清楚，人工半野生栽培需時較長、產(chǎn)量低。豬苓袋料培養(yǎng)及液體培養(yǎng)具有成本低、增殖快等優(yōu)點，是豬苓藥材今后發(fā)展的一個重要方向。本試驗是在前期研究工作的基礎(chǔ)上，研究不同干旱脅迫條件對豬苓液體培養(yǎng)中菌絲生長、多糖質(zhì)量分數(shù)和多糖合成相關(guān)酶活性的影響，以揭示豬苓菌絲耐干旱脅迫程度及其與多糖合成之間的關(guān)系。為豬苓菌絲干旱脅迫適應(yīng)機制及豬苓多糖合成代謝途徑的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株為西北農(nóng)林科技大學中藥材規(guī)范栽培實驗室保藏菌種，產(chǎn)地來源為陜西略陽，經(jīng)西北農(nóng)林科技大學舒志明副教授鑒定為多孔菌科豬苓(P.umbellatus)菌種。培養(yǎng)基為改良完全培養(yǎng)基，設(shè)置不同質(zhì)量濃度(0、50、100、150、200、250 g/L)PEG-6000處理進行液體培養(yǎng)，將豬苓菌種接種后，在恒溫搖床中25 ℃、150 r/min黑暗培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)菌絲用于后續(xù) 試驗。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 生物量測定 豬苓液體培養(yǎng)7 d后，過濾收集豬苓菌絲，于60 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，進行稱量，計算生物量。各處理隨機取樣，重復(fù)3次，下同。

1.2.2 多糖質(zhì)量分數(shù)測定 取烘干至恒質(zhì)量的豬苓菌絲，粉碎后過60目篩。稱取0.10 g粉末，加入30倍蒸餾水，超聲波提取，重復(fù)2次，合并濾液。以葡萄糖為對照，采用硫酸—蒽酮法繪制葡萄糖濃度/吸光度(X/Y)標準曲線，標準曲線為：Y=10.096X-0.030 9(R2=0.999 8)。取待測液測定吸光值，根據(jù)標準曲線計算各樣品的多糖質(zhì)量分數(shù)。

1.2.3 抗氧化酶活性測定 參照李合生[10]的方法測定新鮮豬苓菌絲各項生理指標，采用氮藍四唑(NBT) 法測定超氧化物歧化酶(SOD) 活性，愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD) 活性，高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶(CAT)活性。

1.2.4 丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度測定 采用硫代巴比妥酸(TBA) 法測定新鮮豬苓菌絲中MDA質(zhì)量摩爾濃度。

1.2.5 可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)測定 采用考馬斯亮藍G-250法測定新鮮豬苓菌絲中可溶性蛋白的質(zhì)量分數(shù)。

1.2.6 游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)測定 采用磺基水楊酸法測定新鮮豬苓菌絲中游離脯氨酸的質(zhì)量 分數(shù)。

1.2.7 多糖合成相關(guān)酶活性測定 取不同處理下的新鮮豬苓菌絲，準確稱取0.50 g，加2.5 mL 預(yù)冷細胞提取緩沖溶液(20 mmol/L磷酸鉀鹽緩沖溶液，50 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2和1 mmol/LDTT，pH 6.5)，4 ℃，14 000 r/min離心15 min，取上清，獲得酶液樣品，待測。參照Schaffer等[11]的方法測定己糖激酶(HK)活性；參照Looijesteijn等[12]的方法測定α-磷酸葡萄糖變位酶(α-PGM)和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(GPI)的活性。以不加酶液為空白對照，在340 nm處檢測輔酶Ⅱ NADP(H)的變化，從加入酶液開始讀數(shù)，以反應(yīng)體系中每分鐘增加或減少1 nmol的輔 酶Ⅱ NADP(H) 定義為1個酶活單位(U)。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

采用SPSS 21.0和Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)處理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對豬苓菌絲生長的影響

2.1.1 菌絲生物量 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲生物量的影響較大，如圖1所示。豬苓菌絲生物量隨PEG-6000質(zhì)量濃度升高呈先升高后降低的趨勢，PEG-6000質(zhì)量濃度為50～150 g/L，表現(xiàn)為促進作用，當PEG-6000質(zhì)量濃度為100 g/L時，豬苓菌絲生物量最高，較對照組顯著增加60.40%。當PEG-6000質(zhì)量濃度為200 g/L時，豬苓菌絲生物量與對照組無顯著差異。當PEG-6000質(zhì)量濃度為250 g/L時，豬苓菌絲生長受到抑制。說明適度干旱脅迫有利于豬苓菌絲生長，隨著干旱程度增大，豬苓菌絲生長受到一定威脅。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同 Different lowercase letters indicate the significant difference among different treatments(P<0. 05) . The same below．

圖1 不同干旱脅迫條件下豬苓菌絲生物量
Fig.1 Biomass ofP.umbellatusmyceliumunder different drought stresses

2.1.2 菌絲中抗氧化酶活性 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中POD活性的影響較大，如圖2-A所示。當PEG-6000質(zhì)量濃度為50～150 g/L時，豬苓菌絲中POD活性顯著高于對照組。當PEG-6000質(zhì)量濃度為150 g/L時，POD活性最高，并顯著高于其他處理組。當PEG-6000質(zhì)量濃度為50、100和150 g/L時，POD活性分別較對照組增加6.47倍、9.34倍和12.09倍。當PEG-6000質(zhì)量濃度>150 g/L時，豬苓菌絲中POD活性顯著降低，與對照組無顯著差異。

不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中CAT活性的影響較大，如圖2-B所示。CAT活性隨PEG-6000質(zhì)量濃度升高呈先降低后升高的趨勢。對照組CAT活性顯著高于各處理組。當PEG-6000質(zhì)量濃度為100 g/L和150 g/L時，豬苓菌絲中CAT活性最低，且二者之間無顯著差異，分別較對照組減少17.82%和 15.15%。當PEG-6000質(zhì)量濃度>150 g/L時，CAT活性增強，但仍顯著低于對照組。

不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中SOD活性的影響較大，如圖2-C所示。SOD活性與POD活性變化一致，隨PEG-6000質(zhì)量濃度升高呈先升高后降低的趨勢，當PEG-6000質(zhì)量濃度為150 g/L時，豬苓菌絲中SOD活性最高，較對照組增加2.44倍。當PEG-6000質(zhì)量濃度>150 g/L，SOD活性呈下降趨勢，但在試驗范圍內(nèi)顯著高于對照組。

以上研究結(jié)果表明，PEG-6000模擬干旱脅迫處理下，豬苓菌絲具有一定的自我調(diào)節(jié)能力，以緩解干旱脅迫的抑制作用。

圖2 不同干旱脅迫條件下豬苓菌絲中抗氧化酶活性Fig.2 Antioxidant enzyme activities of P.umbellatus mycelium under different drought stresses

2.1.3 菌絲中丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響較大，如圖3-A所示。豬苓菌絲中MDA質(zhì)量摩爾濃度隨PEG-6000質(zhì)量濃度升高呈先升高后降低的趨勢。當PEG-6000質(zhì)量濃度為50～150 g/L時，MDA質(zhì)量摩爾濃度顯著高于對照組。當PEG-6000質(zhì)量濃度為150 g/L時，MDA質(zhì)量摩爾濃度最高，較對照組顯著增加61.01%。當PEG-6000質(zhì)量濃度>150 g/L時，MDA質(zhì)量摩爾濃度呈下降趨勢。當PEG-6000質(zhì)量濃度為200 g/L時，MDA質(zhì)量摩爾濃度與對照組無顯著差異；當PEG-6000質(zhì)量濃度為250 g/L時，MDA質(zhì)量摩爾濃度顯著低于對照組。

2.1.4 菌絲中游離脯氨酸(Pro)質(zhì)量分數(shù) 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)的影響較大，如圖3-B所示。豬苓菌絲中游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)隨PEG-6000質(zhì)量濃度升高呈先降低后升高的趨勢。其中，對照組游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)最高，且顯著高于各處理組。當PEG-6000質(zhì)量濃度為50～150 g/L時，豬苓菌絲中游離脯氨酸的質(zhì)量分數(shù)呈下降趨勢。當PEG-6000質(zhì)量濃度為150 g/L時，豬苓菌絲中游離脯氨酸的質(zhì)量分數(shù)最低，較對照組顯著減少59.61%。當PEG-6000質(zhì)量濃度>150 g/L 時，豬苓菌絲中游離脯氨酸的質(zhì)量分數(shù)呈上升趨勢，但在試驗范圍內(nèi)顯著低于對照組。當PEG-6000質(zhì)量濃度為100～250 g/L時，不同處理組間游離脯氨酸的質(zhì)量分數(shù)差異不顯著。

2.1.5 菌絲中可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù) 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)的影響較小，如圖3-C所示。豬苓菌絲中可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)隨PEG-6000質(zhì)量濃度升高呈先升高后降低的趨勢。當PEG-6000質(zhì)量濃度為50～100 g/L時，可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)呈上升趨勢，與對照組無顯著差異。其中，當PEG-6000質(zhì)量濃度為100 g/L時，可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)最高，較對照組增加8.80%。PEG-6000質(zhì)量濃度>100 g/L時，豬苓菌絲中可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)呈下降趨勢。當PEG-6000質(zhì)量濃度為150 g/L時，可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)較對照組增加 6.98%，二者差異不顯著。而PEG-6000質(zhì)量濃度為200～250 g/L時，可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)分別較對照組顯著降低15.30%和20.12%。

以上研究結(jié)果表明，干旱脅迫會引起豬苓菌絲細胞損傷，適度干旱脅迫條件下豬苓菌絲具有一定的自我調(diào)節(jié)能力，以緩解干旱脅迫的抑制 作用。

圖3 不同干旱脅迫條件下豬苓菌絲中丙二醛質(zhì)量摩爾濃度(A)、游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)(B)及可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)(C)Fig.3 MDA molality (A) , proline mass fraction (B) andsoluble protein mass fraction(C) of P.umbellatus mycelium under different drought stresses

2.2 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對豬苓菌絲中多糖質(zhì)量分數(shù)的影響

不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中多糖質(zhì)量分數(shù)的影響較大，如圖4所示。豬苓菌絲中多糖質(zhì)量分數(shù)隨PEG-6000質(zhì)量濃度升高呈先升高后降低的趨勢。當PEG-6000質(zhì)量濃度≤100 g/L時，多糖質(zhì)量分數(shù)呈上升趨勢。當PEG-6000質(zhì)量濃度為100 g/L時，多糖質(zhì)量分數(shù)最高，較對照組顯著增加1.06倍。當PEG-6000質(zhì)量濃度>100 g/L時，多糖質(zhì)量分數(shù)呈下降趨勢，但在試驗范圍內(nèi)均高于對照組。當PEG-6000質(zhì)量濃度為150 g/L和200 g/L時，多糖質(zhì)量分數(shù)分別較對照組顯著增加57.61%和 22.73%。當PEG-6000質(zhì)量濃度為250 g/L時，多糖質(zhì)量分數(shù)與對照組差異顯著。適度干旱脅迫能夠提高液體培養(yǎng)豬苓菌絲中多糖的質(zhì)量分數(shù)。

圖4 不同干旱脅迫條件下豬苓菌絲中多糖質(zhì)量分數(shù)Fig.4 Polysaccharide mass fraction of P.umbellatus mycelium under different drought stresses

2.3 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對豬苓菌絲中多糖合成相關(guān)酶活性的影響

2.3.1 己糖激酶(HK)活性 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中HK活性的影響較大，如圖5-A所示。不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理下，豬苓菌絲中HK活性與多糖質(zhì)量分數(shù)變化趨勢一致，呈先升高后降低的趨勢。當PEG-6000質(zhì)量濃度為50 g/L時，豬苓菌絲中HK活性升高，與對照組無顯著差異。當PEG-6000質(zhì)量濃度為100 g/L時，HK活性較對照組顯著升高27.88%。當PEG-6000質(zhì)量濃度>100 g/L時，HK活性呈下降趨勢。當PEG-6000質(zhì)量濃度為150 g/L時，HK活性較對照組升高 5.30%，二者差異不顯著。當PEG-6000質(zhì)量濃度為200 g/L和250 g/L時，HK活性分別較對照組顯著降低15.58%和29.75%。

2.3.2 磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(GPI)活性 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中GPI活性的影響較大，如圖5-B所示。豬苓菌絲中GPI活性與多糖質(zhì)量分數(shù)變化趨勢一致，呈先升高后降低的趨勢。當PEG-6000質(zhì)量濃度為50 g/L時，GPI活性較對照組顯著增加10.60%。當PEG-6000質(zhì)量濃度為100 g/L時，GPI活性達到最高，較對照組顯著增加19.89%。當PEG-6000質(zhì)量濃度>100 g/L時，GPI活性呈下降趨勢，但在試驗范圍內(nèi)顯著高于對照組。當PEG-6000質(zhì)量濃度為150～250 g/L時，GPI活性分別較對照組顯著增加16.54%、13.80%和 11.94%。

2.3.3 α-磷酸葡萄糖變位酶(α-PGM)活性 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對液體培養(yǎng)豬苓菌絲中α-PGM活性的影響較大，如圖5-C所示，豬苓菌絲中α-PGM活性與多糖質(zhì)量分數(shù)變化趨勢一致，呈先升高后降低的趨勢。各處理組α-PGM活性均高于對照組。當PEG-6000質(zhì)量濃度為100、150和200 g/L時，α-PGM活性分別較對照組顯著增加28.73%、18.53%和15.73%。當PEG-6000質(zhì)量濃度為50 g/L和250 g/L時， α-PGM活性分別較對照組增加6.10%和 2.11%，差異不顯著。

以上研究結(jié)果表明，豬苓菌絲中己糖激酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、α-磷酸葡萄糖變位酶活性與豬苓多糖質(zhì)量分數(shù)變化趨勢一致，且適度干旱脅迫可以提高其活性。

圖5 不同干旱脅迫條件下豬苓菌絲中己糖激酶(A)、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(B)和α-磷酸葡萄糖變位酶(C)活性Fig.5 Activities of HK (A), GPI (B) and α-PGM (C) of P.umbellatus mycelium under different drought stresses

3 結(jié)論與討論

高巧妮等[13]研究發(fā)現(xiàn)，豬苓菌核培養(yǎng)過程中水分變化會對豬苓菌絲生長產(chǎn)生重要影響。本研究通過外源添加PEG-6000模擬干旱脅迫，探究其對豬苓菌絲生長及多糖合成相關(guān)酶活性的影響。結(jié)果表明，在不同質(zhì)量濃度PEG-6000模擬干旱脅迫下，豬苓菌絲生長和多糖合成相關(guān)酶活性均受到一定影響。

水分是中藥材人工栽培過程中影響藥材產(chǎn)量的重要因素。干旱脅迫抑制植株生長，且抑制作用隨脅迫程度增大而增大。劉艷等[14]研究結(jié)果表明，輕度干旱脅迫促進甘草根系生長。高揚[15]研究結(jié)果表明，中度干旱脅迫抑制丹參干物質(zhì)積累。本研究結(jié)果表明，PEG-6000質(zhì)量濃度≤150 g/L時促進豬苓菌絲生長，PEG-6000質(zhì)量濃度為250 g/L時顯著抑制豬苓菌絲生長。

SOD、POD和CAT是生物體內(nèi)的保護酶，與機體抗逆性緊密相關(guān)，本研究結(jié)果表明，當豬苓菌絲遭受不同程度干旱脅迫時，這3種酶表現(xiàn)出不同的活性。當PEG-6000質(zhì)量濃度≤150 g/L時，豬苓菌絲中SOD和POD活性顯著升高，CAT活性顯著降低，說明豬苓菌絲具有一定適應(yīng)干旱脅迫的能力。當PEG-6000質(zhì)量濃度>150 g/L時，豬苓菌絲生物量、POD活性、SOD活性、MDA質(zhì)量摩爾濃度、可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)及多糖質(zhì)量分數(shù)均隨脅迫程度增大顯著降低。說明豬苓菌絲適應(yīng)干旱脅迫能力具有一定范圍，超過此范圍會導致豬苓菌絲中保護酶功能失衡，過氧化程度加劇，造成細胞損傷。

干旱是全球普遍存在的現(xiàn)象，全球氣候變暖和雨水不均導致的干旱脅迫會對作物生長及次生代謝物合成產(chǎn)生影響。中藥材人工栽培過程中常受到干旱的影響，但適度干旱脅迫有利于道地藥材形成[16]。周雪潔等[17]研究結(jié)果表明，中度干旱脅迫后短期復(fù)水可以促進甘草酸積累。高揚[15]研究結(jié)果表明，中度干旱促進丹參中丹參素和丹參酮ⅡA的積累。本研究結(jié)果表明，適度干旱脅迫有利于提高豬苓菌絲中的多糖質(zhì)量分數(shù)，并提高多糖合成相關(guān)酶活性，多糖質(zhì)量分數(shù)與HK、GPI和α-PGM 3種酶活性變化趨勢一致，此結(jié)果與余吳夢曉等[18]及李潔[19]的研究結(jié)果一致。目前豬苓多糖合成代謝途徑尚不明確，但有關(guān)多糖合成酶的相關(guān)研究卻較多。有研究表明，HK在糖核苷酸合成途徑以及糖代謝途徑中可能扮演重要角色[20-22]，GPI和α-PGM是多糖合成途徑的關(guān)鍵酶[23-28]，該3種酶是否為豬苓多糖合成的關(guān)鍵酶還有待進一步研究。