綿羊miRNA-411a與其靶基因FLT3的相互作用

張夢(mèng)丹，劉 莉，徐越仁，李慧向，倪 偉，李 剛

(石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000)

miRNAs是一類長約22nt的非編碼單鏈小RNA分子，廣泛存在于人類及其他各種真核生物中，它們可以直接通過與靶mRNA特異性的堿基互補(bǔ)配對(duì)引起靶mRNA降解或抑制其翻譯，或者間接影響轉(zhuǎn)錄因子的甲基化，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平。自1993年miRNAs被發(fā)現(xiàn)后，迅速成為當(dāng)前人們研究的熱點(diǎn)。研究表明，miRNA在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要作用[1]，它主要是與靶基因3′UTR結(jié)合[2-3]，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平，影響相應(yīng)的蛋白合成，對(duì)生物體的正常功能產(chǎn)生影響。

最近，通過對(duì)miRNAs的研究，大量試驗(yàn)證實(shí)miRNAs的表達(dá)與否及表達(dá)量的變化與哮喘[4]、慢性阻塞性肺炎、囊性纖維化[5]、特發(fā)性肺纖維化[6]等幾種肺部疾病相關(guān)，綿羊支原體肺炎的病理特征與這些疾病類似，但在綿羊支原體肺炎方面的相關(guān)研究甚少。

支原體肺炎引起的綿羊慢性呼吸道疾病給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失，感染其病可降低綿羊的免疫力，造成較高的患病率及死亡率[7-8]。目前的防治措施主要是注射疫苗和抗生素。雖然疫苗可以降低發(fā)病率，但不能降低支原體的定植，且不能阻止支原體的感染；而長期使用抗生素會(huì)產(chǎn)生耐藥性，并且會(huì)有藥物殘留。因此，初步探討miR-411a與FLT3基因的相互作用，為進(jìn)一步研究相關(guān)miRNAs及其靶基因在綿羊支原體肺炎中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品、細(xì)胞系和載體

動(dòng)物樣品采自沙灣縣屠宰場；293T細(xì)胞系由上海豐壽生物科技有限公司提供；表達(dá)載體pcDNA 3.1(+)由優(yōu)寶生物科技有限公司提供；表達(dá)載體pMIR-Report Luciferase由Thermo Fisher Scientific公司提供。

1.2 主要試劑

瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、氨芐西林、青鏈霉素、DMEM、opti-MEM、胰蛋白酶、胎牛血清、Trizol，均由生工生物工程(上海)有限公司提供。無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供。PCR引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 miR-411a和靶基因的預(yù)測(cè)與分析 用TargetScan、miRDB和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/index.html)等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miRNA的靶基因，分析miR-411a與FLT33′UTR的堿基配對(duì)情況、二者結(jié)合形成的雙鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)和靶序列在不同物種間的保守性等。

1.3.2 綿羊基因組DNA的獲取 剪取綿羊肌肉組織，使用基因組DNA提取試劑盒提取肌肉組織的基因組DNA。通過Nanodrop1000對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行OD值(260/280)檢測(cè)。

1.3.3 miR-411a引物合成和基因的克隆 查找綿羊miR-411a基因的成熟序列(oar-mir-411a MI0016918)，截取前體序列及其左右側(cè)翼各200 bp的序列，設(shè)計(jì)特異性引物，并在引物5′端添加HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。引物序列見表1(劃線部分為酶切位點(diǎn))。

表1 綿羊 miR-411a基因PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence of sheep miR-411a gene

PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×TaqPCR MasterMix 10 μL，上游和下游引物(10 pmol/μL)各0.5 μL，DNA模板(20 ng/μL) 2 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件： 94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 延伸2 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用20 g/L脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.4FLT3基因的引物合成及克隆 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中發(fā)布的綿羊FLT3基因序列(登錄號(hào)為NC_019467)，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，并在引物的5′端添加SacⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。引物序列見表2，劃線部分為酶切位點(diǎn)。

表2 綿羊 FLT3基因PCR引物序列Table 2 PCR primer sequences for sheep FLT3 gene

PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×TaqPCR MasterMix 10 μL，上游和下游引物(10 pmol/μL)各0.5 μL，DNA模板(20 ng/μL) 2 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 8 s，共35個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 延伸2 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

利用TANGEN瓊脂糖凝膠回收試劑盒對(duì)miR-411a和FLT3的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。

1.3.5 pcDNA3.1-411a重組載體的構(gòu)建 分別對(duì)提取的miR-411a基因和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒用HindⅢ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，放于37 ℃水浴鍋中，酶切體系(總體積為20 μL)：2 μL 10×Q Buffer，1 μLHind Ⅲ，1 μLEcoRⅠ，6 μL miR-411a(pcDNA3.1(+))，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。用DNA純化試劑盒純化miR-411a基因酶切產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收pcDNA3.1(+)酶切產(chǎn)物。加入SolutionⅠ，16 ℃過夜連接miR-411a和pcDNA3.1(+)，連接體系(總體積為10 μL)：5 μL Solution I，2.5 μL miR-411a，2.5 μL pcDNA3.1(+)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，菌液PCR和測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒。

1.3.6 pMIR-RL-FLT3重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用SacⅠ和Hind Ⅲ 于37 ℃水浴中分別對(duì)提取的FLT3基因和pMIR-RL進(jìn)行雙酶切，其余方法同“1.3.5”。重組質(zhì)粒pMIR-RL-FLT3構(gòu)建成功后，按照說明書使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒進(jìn)行重組質(zhì)粒提取。

1.3.7 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將在液氮中凍存的293T細(xì)胞接種到含有生長培養(yǎng)液(DMEM+10%FBS+1%雙抗)的3.5 cm細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗3遍，并將培養(yǎng)液換成Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，放置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。將4 μL表達(dá)載體pcDNA 3.1-411a+GFP(綠色熒光蛋白基因質(zhì)粒)和Lipofectamine 2000分別與50 μL的Opti-MEM混勻，室溫條件下孵育5 min；之后將pcDNA 3.1-411a+GFP混合液與Lipofectamine 2000混合液混勻，室溫條件下孵育20 min；將混合液分別滴加至細(xì)胞板的每個(gè)孔中，并以“∞“型混勻混合液與培養(yǎng)液，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；其中轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1(+)空載體質(zhì)粒的為對(duì)照組。6 h后將培養(yǎng)液更換成生長培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后觀察熒光。

1.3.8 RT-PCR檢測(cè)miR-411a和FLT3基因的表達(dá)量 使用293T-β-actin作為內(nèi)參基因，查閱文獻(xiàn)設(shè)計(jì)β-actin引物。使用莖環(huán)法設(shè)計(jì)miR-411a的反轉(zhuǎn)錄引物及上下游引物。引物信息見表3。

表3 293T-β-actin和miR-411a的RT-PCR引物序列Table 3 RT-PCR primer sequences for 293T-β-actin and miR-411a

收集轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞，利用超純RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并用TAKARA PrimeScript RT Reagent反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA， cDNA合成體系(總體積為10 μL)：2 μL 5×PrimerScript Buffer，0.5 μL PrimeScript RT Enzyme Mix×1，0.5 μL Random 6 mers，0.5 μL RT Primer，6.5 μL總RNA，通過PCR檢測(cè)基因的表達(dá)，采用RT-PCR檢測(cè)miR-411a和FLT3基因的表達(dá)量。

1.3.9 雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè) 轉(zhuǎn)染方法同“1.3.7”，將轉(zhuǎn)染的GFP基因質(zhì)粒換為pRL-TK(pMIR-REPORTTM Luciferase，海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒)，轉(zhuǎn)染36 h后，用PBS清洗3遍細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，在搖床上震蕩10 min后，收集至離心管中，12 000 r/min離心10 min后，吸取上清，得到細(xì)胞裂解物。用TransDetect Double-Luciferase Reporter Assay Kit進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。提前30 min開啟化學(xué)發(fā)光儀，將100 μL Luciferase Reaction Reagent加入白色的96孔板中，吸取20 μL細(xì)胞裂解物，檢測(cè)螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的活性。再加入100 μL Luciferase Reaction Reagent Ⅱ，充分混勻，檢測(cè)海腎熒光素酶報(bào)告基因的活性。計(jì)算方法：相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的活性/海腎熒光素酶報(bào)告基因的活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-411a和靶基因的預(yù)測(cè)與分析

預(yù)測(cè)得知靶序列FLT33′UTR與miR-411a序列互補(bǔ)配對(duì)(圖1-A)，二者形成的RNA雙鏈自由能為-4.89 kJ/mol(圖1-B)，靶序列FLT3在不同物種間高度保守(圖1-C)，以上結(jié)果表明FLT33′UTR與miR-411a具有相互作用。

2.2 miR-411a與FLT3基因的克隆

分別對(duì)miR-411a和FLT3基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可觀察到約485 bp和165 bp處有清晰的條帶(圖2)。

2.3 pcDNA3.1-411a和pMIR-RL- FLT3表達(dá)載體的酶切驗(yàn)證及測(cè)序驗(yàn)證

提取pcDNA3.1-411a質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒用Hind Ⅲ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，并經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察到在5 428 bp和485 bp處都有單一清晰條帶，說明411a基因片段成功連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上，結(jié)果見圖3-A。同時(shí)提取pMIR-RL-FLT3質(zhì)粒，酶切方法同上，觀察到在6 479 bp和165 bp處都有單一清晰條帶，說明FLT3基因片段也成功連接到表達(dá)載體上，結(jié)果見圖3-B。利用DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果與已知基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，測(cè)序所得的序列與參考序列完全一致，說明無堿基突變。

A.FLT33′UTR與miR-411a序列堿基互補(bǔ)配對(duì)FLT33′UTR is complementary to the miR-411a sequence; B.FLT33′UTR與miR-411a形成雙鏈RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)(自由能：-4.89 kJ/mol)FLT33′UTR and miR-411a form the secondary structure of double-stranded RNA (free energy: -4.89 kJ/mol); C.FLT3靶序列在常見物種間的保守性FLT3target sequence conservative between common species

圖1 miR-411a和靶基因的生物信息學(xué)分析
Fig.1 Bioinformatics analysis of miR-411a and target genes

A:M.DL1000 DNA marker; D.陰性對(duì)照 Negative control;1.miR-411a

B:M.DL500 DNA marker; D.陰性對(duì)照 Negative control;1.FLT3

圖2 miR-411a和FLT3基因的克隆結(jié)果
Fig.2 Cloning results of miR-411a andFLT3genes

A:M.DL10000 DNA marker; 1.重組質(zhì)粒對(duì)照 Recombinant plasmid control;2.pcDNA3.1+411a

B:M.DL500 DNA marker;1.重組質(zhì)粒對(duì)照 Recombinant plasmid control;2.pMIR-RL+FLT3

圖3 重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證結(jié)果
Fig.3 Recombinant plasmid digestion results

2.4 過量表達(dá)載體pcDNA3.1-411a的真核表達(dá)

將過量表達(dá)載體pcDNA3.1-411a+GFP轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞24 h后，在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光，表明過量表達(dá)載體在293T細(xì)胞中成功表達(dá)，結(jié)果見圖4。

2.5 miR-411a和 FLT3基因的RT-PCR分析

提取轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示所需基因都正常表達(dá)且大小正確，內(nèi)參基因使用β-actin，結(jié)果見圖5。

2.6 qPCR驗(yàn)證miR-411a過量表達(dá)以及miR-411a與 FLT3的相互作用

與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組pcDN A3.1-miR-411a的表達(dá)量極顯著上調(diào)(P<0.01)，說明miR-411a過量表達(dá)載體的表達(dá)效果較好，如圖6-A；過量表達(dá)miR-411a后，其靶基因FLT3mRNA的表達(dá)量極顯著下調(diào)(P<0.01),說明過量表達(dá)miR-411a能顯著抑制FLT3mRNA的表達(dá)量，如圖6-B，表明FLT3是miR-411a的靶基因，且miR-411a對(duì)靶基因FLT3的表達(dá)存在抑制作用。

圖4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞熒光觀察(4×)Fig.4 Fluorescence observation of plasmid transfected 293T cells (4×)

2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-411a與 FLT3的相互作用

由圖7可以看出，與對(duì)照組相比，過量表達(dá)miR-411a的試驗(yàn)組顯著抑制FLT3雙熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)(P<0.01)，結(jié)果驗(yàn)證FLT3是miR-411a的靶基因。

M.50 bp DNA Ladder;1.陰性對(duì)照 Negative control; 2.β-actin;3.miR-411a; 4.FLT3

圖5 RT-PCR電泳結(jié)果
Fig.5 RT-PCR results

A.miR-411a過量表達(dá)載體效率 miR-411a overexpression vector efficiency; B.miR-411a過量表達(dá)后FLT3mRNA的相對(duì)表達(dá)量 Relative expression ofFLT3mRNA after overexpression of B miR-411a；**表示差異極顯著(P<0.01) ** indicates a significant difference (P<0.01)。下同 The same below

圖6 qPCR檢測(cè)結(jié)果
Fig.6 qPCR test results

圖7 雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Detection results of dual luciferase reporter gene

3 討 論

大量研究表明miRNA參與肺部疾病的調(diào)控過程。國內(nèi)彭秀麗團(tuán)隊(duì)以雞胚成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)miRNA靶向靶基因在宿主防御雞毒支原體(HS株)感染進(jìn)行研究，分別研究了gga-miR-101-3p和gga-miR-19a等通過結(jié)合靶基因3′非翻譯區(qū)(3′UTR)來調(diào)節(jié)靶基因宿主增強(qiáng)子的表達(dá)[9-10]。

相關(guān)研究報(bào)道m(xù)iR-411可能在癌癥中起上調(diào)或下調(diào)作用。例如，Guo等[11]報(bào)道m(xù)iR-411在乳腺癌中顯著下調(diào)，miR-411的過表達(dá)通過靶向特異性蛋白顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲。Xia等[12]發(fā)現(xiàn)miR-411的表達(dá)通過靶向ITCH表達(dá)促進(jìn)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖。最近，Nadal等[13]報(bào)道m(xù)iR-411在肺癌中的表達(dá)顯著上調(diào)；也有人將血清中miR-411作為非小細(xì)胞肺癌診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[14]。

FLT3(Fms-like tyrosine kinase, FMS樣的酪氨酸激酶3)屬于Ⅲ 型受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase Ⅲ , RTK Ⅲ )家族成員，近年來，許多大樣本研究已經(jīng)證實(shí)FLT3的激活突變?cè)诎籽〉陌l(fā)生及疾病的進(jìn)展中起到十分重要的病理作用[15]。前人研究表明FLT3可以增強(qiáng)慢性阻塞性肺疾病的抗病力，在炎癥方面的研究為本試驗(yàn)提供了新方向[16]。

miRNA與靶基因的關(guān)系可以通過軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)到的數(shù)量與日俱增，本研究利用常用的雙熒光素酶報(bào)告基因法，構(gòu)建FLT33′UTR的雙熒光素酶報(bào)告載體，結(jié)果在細(xì)胞水平證明了FLT3是oar-miR-411a的靶基因，這種方法簡單快速證實(shí)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果。

通過對(duì)miRNA高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-411a在支原體肺炎感染的肺組織中高表達(dá)。通過利用一些生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)分析顯示，F(xiàn)LT3是miR-411a的靶基因，miRNA一般作用于靶基因mRNA的非編碼區(qū)，miR-411a通過與FLT33′UTR互補(bǔ)配對(duì)，形成雙鏈RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)(自由能：-11.7 kcal/mol)，沉默F(xiàn)LT3。靶序列FLT3在常見物種中高度保守。本試驗(yàn)進(jìn)行miRNA-411a及其靶基因FLT3的研究分析，驗(yàn)證兩者的相互作用。結(jié)果表明：成功構(gòu)建pcDNA3.1-411a和pMIR-RL-FLT3真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過qPCR檢測(cè)靶基因的相對(duì)表達(dá)量，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)相對(duì)活性，發(fā)現(xiàn)miRNA-411a顯著抑制FLT3的表達(dá)。表明FLT3是miRNA-411a的靶基因。

綿羊支原體肺炎作為一種傳染性疾病嚴(yán)重的威脅著家畜和牧民的健康。本研究從本地感染支原體肺炎的綿羊入手，利用生物信息學(xué)方法分析和細(xì)胞水平試驗(yàn)相結(jié)合，對(duì)綿羊支原體感染相關(guān)的miRNAs進(jìn)行鑒定，初步闡明其調(diào)控和響應(yīng)機(jī)制，為進(jìn)一步研究相關(guān)miRNAs及其靶基因在綿羊支原體肺炎疾病中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)，也為支原體引起的綿羊慢性呼吸道疾病的診斷和治療提供新的分子靶標(biāo)及理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究通過構(gòu)建、轉(zhuǎn)染2種真核表達(dá)載體，成功驗(yàn)證oar-miRNA-411a及其靶基因FLT3相互作用，揭示miRNA通過調(diào)控靶基因表達(dá)對(duì)支原體感染起重要作用，為支原體發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。