“乳黃消散”對臨床型奶牛乳房炎治療效果

張 行，李新圃，楊 峰，王旭榮，羅金印，白東東，李宏勝

(中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州 730050)

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中最常見的一種疾病，是奶牛乳房受到病原菌侵襲或機械損傷而引起的奶牛乳腺組織炎癥。在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中，奶牛乳房炎是花費成本最高的一類疾病，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的直接和間接經(jīng)濟損失。直接經(jīng)濟損失包括治療成本、患乳的廢棄、治療后乳房炎復發(fā)所需的周期性非產(chǎn)奶時間等，間接經(jīng)濟損失包括產(chǎn)奶量下降、乳品質(zhì)量降低、干奶期提前和淘汰率增加等。引起奶牛乳房炎的病原菌可分為傳染性致病菌和環(huán)境型致病菌，其中傳染性致病菌主要以金黃色葡萄球菌和鏈球菌為主，環(huán)境型致病菌與奶牛的棲息環(huán)境密切相關(guān)，較常見的是大腸桿菌和克雷伯氏菌屬[1]。長期以來，國內(nèi)外對奶牛乳房炎的防治主要以抗生素治療為主[2-4]。但由此造成的嚴重后果也愈加突出，除了較高的治療成本外，由于長期過量使用、濫用抗生素導致的細菌耐藥性甚至多重耐藥細菌的出現(xiàn),以及乳汁中抗生素殘留等問題也日益嚴重，嚴重制約奶牛業(yè)的健康發(fā)展，也給人們的身體健康帶來嚴重威脅[5-6]，隨著人們更青睞于綠色、無抗、有機奶制品，以及世界范圍內(nèi)對抗生素使用的要求越來越嚴格，抗生素在臨床中的應用越來越受限制[7]。此外，生物被膜的產(chǎn)生更增強了細菌對抗生素的耐藥性[8]。中藥為純天然植物，含有多種生物活性成分，具有抗菌、消炎、不易產(chǎn)生耐藥性、低或無殘留等特點，另外，有些中藥成分還具有增強機體免疫力、提高動物生產(chǎn)性能等輔助功效。因此，應用中藥治療奶牛乳房炎已成為國內(nèi)外學者研究的焦點，具有廣闊的市場前景[9-14]。

1 材料與方法

1.1 試驗用藥物

“乳黃消散”規(guī)格為每袋500 g，由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所中獸醫(yī)研究室生產(chǎn)，主要由丹參、遠志、連翹、地膚子等10味藥材組成。對照藥物為市售“公英散”，規(guī)格為每袋 500 g，主要由蒲公英、金銀花、連翹、芙蓉葉等組成，批準文號為獸藥字(2012)031045028，河北寶典藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號為20170701。

1.2 主要試劑及器材

營養(yǎng)肉湯、血平板均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，Bacterial DNA Kit購自OMEGA公司，16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit購自TaKaRa公司，SEDI PCR儀購自威泰克公司，隔水式恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科學儀器有限公司。蘭州隱性乳腺炎診斷液(LMT) 由中國農(nóng)業(yè)科學院中獸醫(yī)研究所藥廠生產(chǎn)，批號為20160808。診斷及檢測判定標準參照產(chǎn)品說明書及文獻[15]進行，將待測乳汁擠入診斷盤中，將診斷盤傾斜大約 60°，棄去多余乳樣，使檢驗杯中乳樣約為 2 mL，加入2 mL LMT診斷液，水平同心圓旋轉(zhuǎn)搖動診斷盤 5～30 s，60 s 內(nèi)判斷結(jié)果，分為“-”(陰性)，“+”(可疑)，“+”(弱陽性)，“++”(陽性)，“+++”(強陽性)。

1.3 試驗動物分組及乳樣采集

將甘肅省某奶牛場40頭患臨床型乳房炎的泌乳牛隨機分成4組(表1)，分別為高、中、低劑量 “乳黃消散”處理組和1個“公英散”對照組。采樣前，先用溫水清洗乳頭，再用體積分數(shù)為75%的酒精棉球擦拭乳頭與擠奶者手指，棄去前3把奶樣，用滅菌試管接取2～5 mL左右的奶樣，擰緊瓶塞，注明采樣的時間、牛號、乳區(qū)，并及時 送檢。

表1 試驗奶牛分組及給藥情況Table 1 Test grouping and administration of dairy cows

1.4 細菌的分離與鑒定

將治療前后采集的奶樣搖勻后，每份樣品用接種針無菌挑取2～3鉑耳圈劃線于血瓊脂平板，同時吸取該奶樣20 μL接種于2 mL營養(yǎng)肉湯管中，用以增菌培養(yǎng)，均于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h，取出血瓊脂平板后挑取可疑單菌落接種于營養(yǎng)肉湯管中，進行純化培養(yǎng)，對于血平板上未長菌者，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，并取其增菌肉湯再劃血平板培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后仍未長菌的，即可認為無細菌生長。

將純化的單菌落肉湯培養(yǎng)液涂片進行革蘭氏染色，鏡檢純粹后，根據(jù)菌體顏色，結(jié)合菌落形態(tài)、特性，將分離純化的細菌分為鏈球菌、葡萄球菌、腸桿菌、革蘭氏陽性桿菌等，并提取細菌基因組DNA，PCR擴增16S rRNA基因并測序，在NCBI上在線比對16S rRNA基因序列，確定病原菌種類。

1.5 治療方法

首先將待治療奶牛用牛鼻鉗固定，將“乳黃消散”和“公英散”分別用溫開水沖調(diào)混勻，待溫度降至40 ℃左右時，用灌胃瓶緩慢灌服，每天灌服1次，連續(xù)用藥3～5 d。其中“乳黃消散”低劑量組每次灌服1袋，中劑量組每次灌服2袋，高劑量每次灌服3袋；對照藥物“公英散”每次灌服1袋，治療結(jié)束后觀察治療效果、LMT檢測情況及乳汁細菌檢測情況。

1.6 療效評價

治療后，患牛乳房紅腫、硬結(jié)、熱感消失，奶樣外觀、采食量、奶產(chǎn)量和精神恢復正常，為痊愈；乳房紅腫、硬結(jié)和熱脹感明顯減輕，乳汁水樣或絮狀沉淀減少或消失，奶產(chǎn)量有所增加，為有效；乳房臨床癥狀未改善或情況惡化，放棄本中藥治療而用其他方法治療，為無效。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 25.0單因素 ANOVA 處理，分析不同劑量組之間治療效果的差異顯 著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床治療效果

由表2可知，對照組的治愈率極顯著低于試驗組的治愈率(P<0.01)，低劑量組的治愈率極顯著低于中劑量和高劑量組(P<0.01)，中劑量組的治愈率極顯著高于高劑量組(P<0.01)；對照組的總有效率極顯著低于3個試驗組，低劑量組的總有效率極顯著低于中劑量組和高劑量組(P<0.01)，中劑量組的總有效率極顯著高于高劑量組(P<0.01)。

表2 “乳黃消散”與“公英散”治療臨床型奶牛乳房炎臨床效果統(tǒng)計Table 2 Statistics on the clinical effects of “Ruhuangxiaosan” and “Gongyingsan” in the treatment of clinical bovine mastitis

注：用Duncan氏法進行多重比較，同列標注不同大寫字母表示組間差異極顯著(P<0.01);-.陰性，+.可疑，+.弱陽性，++.陽性， +++.強陽性。

Note:Multiple comparisons were performed using the Duncan’s method.Different capital letters in the same column indicate that the differences between the groups are extremely significant (P<0.01); -.Negative,+.Suspicious,+.Weak positive,++.Positive, +++.Strong positive.

2.2 “乳黃消散”與“公英散”治療前后奶樣中的細菌變化情況

治療前后乳汁細菌檢測結(jié)果顯示(表3)，治療前采集的40個乳區(qū)樣品中有35個樣品檢出細菌，細菌檢出率為87.50%，主要為大腸桿菌、無乳鏈球菌、屎腸球菌和乳房鏈球菌等。治療結(jié)束后3～5 d同一乳區(qū)檢菌結(jié)果顯示，試驗組的細菌總轉(zhuǎn)陰率達66.67%～100.00%，細菌轉(zhuǎn)陰率為馬胃葡萄球菌、乳房鏈球菌和巨型球菌最高 (100.00%)，其次是無乳鏈球菌(83.33%)和大腸桿菌(80.00%)，屎腸球菌轉(zhuǎn)陰率最低(66.67%)，對照“公英散”組的細菌總轉(zhuǎn)陰率達50.00%～ 100.00%。

表3 治療前后奶樣中細菌變化情況Table 3 Changes of bacterial in milk samples before and after treatment of dairy cows with clinical mastitis

3 討 論

目前，對于奶牛乳房炎的治療主要還是以抗生素為主。由于抗生素的濫用，造成乳汁中藥物殘留及耐藥菌株增多，使乳房炎的治療效果下降。因此，用中藥治療奶牛乳房炎成為國內(nèi)外學者研究的方向[13-14,16]。在中獸醫(yī)學研究中，奶牛乳房炎又被稱為乳癰，中獸醫(yī)解釋為“無血則乳無以生，無氣則乳無以化”，是因外部邪毒侵入乳房與積乳互結(jié)，造成乳腺乳絡不暢，導致動物機體陰陽失衡而引起。臨床上主要癥狀表現(xiàn)為乳房紅腫、硬結(jié)、乳汁水樣變性或血乳，患牛精神萎靡、體溫升高、奶產(chǎn)量及采食量減少。為此，中獸醫(yī)以清熱解毒、活血通乳、抗菌消炎及消腫祛痛為治療原則，通過調(diào)理并改善動物機體的各種生理功能達到有效治療奶牛乳房炎的目的。本研究結(jié)果顯示，“乳黃消散”低劑量組治愈率60.00%，總有效率80.00%，平均治療時間3.7 d，治療后乳汁LMT檢測由“+++”轉(zhuǎn)為“+或+”；中劑量組治愈率90.00%，總有效率100.00%，平均治療時間3.2 d，治療后乳汁LMT檢測由“+++”轉(zhuǎn)為“-或+”；高劑量組治愈率70.00%，總有效率90.00%，平均治療時間為3.6 d，治療后乳汁LMT檢測由“+++”轉(zhuǎn)為“+或-”；“公英散”治愈率50.00%，總有效率70.00%，平均治療時間4.1 d，治療后乳汁LMT檢測由“+++”轉(zhuǎn)為“+或+”。 “乳黃消散”高、中、低3個劑量組治愈率與總有效率均極顯著高于對照“公英散”組 (P<0.01)，而“乳黃消散”中劑量組治愈率及總有效率極顯著高于高劑量組和低劑量組 (P<0.01)，表明“乳黃消散”中劑量是治療臨床型奶牛乳房炎的最佳劑量。本次試驗“乳黃消散”高和低2個劑量組的臨床治愈率與郭蕾等[17]、張玲等[18]、王學紅等[19]和董奎龍等[20]的結(jié)果基本一致，但中劑量組的臨床治愈率較高，分析原因可能與用藥量偏大及收治病例較少有關(guān)，需進一步擴大臨床試驗加以驗證。本研究還發(fā)現(xiàn)，臨床治愈率的高低與平均治療時間及LMT檢測的嚴重程度存在顯著的相關(guān)性，即治愈率越高，平均治療時間越短，乳汁LMT檢測嚴重程度越低。治療前后乳汁細菌檢測結(jié)果顯示，治療前采集的40個乳區(qū)樣品有35個樣品檢出細菌，細菌檢出率為87.50%。治療結(jié)束后3～5 d同一乳區(qū)檢菌結(jié)果顯示，“乳黃消散”3個劑量組的細菌總轉(zhuǎn)陰率達66.67%～ 100.00%。對照“公英散”組的細菌總轉(zhuǎn)陰率達50.00%～100.00%。細菌轉(zhuǎn)陰率按照高低排列主要為馬胃葡萄球菌、乳房鏈球菌和巨型球菌最高(100.00%)，其次是無乳鏈球菌 (83.33%)和大腸桿菌(80.00%)，屎腸球菌轉(zhuǎn)陰率最低 (66.67%)。目前，國內(nèi)外學者對于藥物治療奶牛乳房炎前后進行乳汁中細菌變化情況的研究鮮有報道。對于臨床型奶牛乳房炎的療效判定標準，通常以患牛精神、食欲及奶產(chǎn)量基本恢復正常，乳房紅、腫、熱、痛及硬結(jié)消失、乳汁肉眼觀察轉(zhuǎn)為白色、無絮狀物及沉淀等指標來判定是否治愈。然而，單從肉眼觀察臨床癥狀消失即判定為臨床治愈，會造成有些泌乳牛乳房炎復發(fā)，這可能與乳汁中細菌沒有完全轉(zhuǎn)陰有一定關(guān)系[10]。另外，有研究表明，乳汁體細胞數(shù)與奶牛乳房炎的發(fā)生呈正相關(guān)，可以作為評判奶牛乳房感染程度的重要指標[21]。因此，對于臨床型奶牛乳房炎療效的判定，除觀察臨床癥狀，還應結(jié)合細菌學及乳汁體細胞檢測，這樣才更加合理全面。本次“乳黃消散”臨床試驗表明，中劑量治療奶牛乳房炎效果最好，但由于每次口服1 000 g，可能造成治療成本偏高。因此，今后在保證療效的基礎上，如何降低成本可能是中獸藥治療奶牛乳房炎亟需解決的問題。未來中獸藥的推廣與應用，可大大減少抗生素在治療奶牛乳房炎上的使用，降低細菌耐藥性的產(chǎn)生與乳汁中抗生素殘留等問題。中獸藥現(xiàn)代化的發(fā)展，為奶牛乳房炎提供一種新的治療途徑，具有非常可觀的開發(fā)應用前景。